四种植物病毒单隆抗体和传染性法氏囊病病毒疫苗研制及应用.pdf

摘要 一、传染性法氏囊病病毒VP2蛋白在水稻稻米中的表达及其免疫原性和免疫保护性 bursal 传染性法氏囊病病毒(Infectiousdisease 特征的急性接触性传染病，且该病毒造成鸡群对其它病原的易感性增强和免疫失败，给养 禽业带来巨大的经济损失。由于自上世纪80年代开始出现IBDV变异株和超强毒株，使传 统的灭活苗和弱毒苗防治逐渐失去意义。且传统的疫苗存在许多不足，如灭活苗存在昂贵、 低效、免疫麻烦，而弱毒苗由于基因重组产生IBDV新的变异株等。因此，研究安全、廉 价、有效的新型疫苗对于预防传染性法氏囊病(IBD)十分必要。为了研究水稻作为生物反应 器表达IBDVVP2蛋白及表达的重组蛋白用于IBDV亚单位疫苗的可行性，我们进行了 IBDV VP2在转基因水稻稻米中特异性表达。 三亲交配导入EHAl05根癌土壤杆菌中。利用根癌土壤杆菌介导系统转化粳稻品种秀水1l 成熟胚愈伤。PCR和Southernblot检测证明121株再生水稻基因组内已整合IBDVVP2基 Western．blot分析表明，转基因水稻稻米提取物中有一分子量约50 血清反应，但不同转基因稻米的反应条带的颜色深浅及大小不同，进一步说明VP2蛋白在 转基因水稻稻米中表达量不一。 观病变、囊体比值、组织切片病理学观察表明，高剂量免疫鸡(口服免疫5g转基因水稻稻 米)的免疫保护率为83．33％(5／6)，但随着免疫剂量减到3g、lg时，其免疫保护率也分 生高效价的中和抗体，但中和抗体效价随着免疫剂量的减少而下降，即中和抗体效价存在 剂量依赖关系。这些结果表明转基因水稻稻米表达的IBDVVP2蛋白能在免疫鸡体内产生强 烈的免疫反应，并诱导产生高水平IBDV中和抗体，具有良好的免疫原性和免疫保护性。将 二周龄的小鸡每天每只口服免疫25 g转基因稻米一个月，在观察的两个月内没有发生死亡、 ¨ 副作用及任何疾病症状。转基因稻米组的平均体重(3．12kg)与免疫25g非转基因稻米对 照组(3．20 kg)没有显著差异，表明转基因水稻稻米表达的VP2蛋白可作为有效、安全、廉 价的IBDV亚单位疫苗。 二、四种病毒的单克隆抗体研制及其应用 番茄斑萎病毒(Tomatowild spotted 世界范围内的许多重要的观赏植物及蔬菜植物上引起巨大损失。该病毒主要由蓟马传播， 可感染1000多种单子叶和双子叶植物。用RT-PCR方法从TSWv OiGpTsl分离物中克隆到 kDa的核衣壳蛋白基因(Ⅳ基因，777 编码约29 菌中表达了TSWVN蛋白，并用Western 脂亲和纯化了重组TSWVN蛋白。以重组蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，用杂交瘤细胞技 术制备了3株能够稳定传代并分泌抗TSWV 的杂交瘤细胞株，并制备了单克隆抗体腹水。Westernblot分析表明，3株单克隆抗体与 TSWV29kDa的核衣壳蛋白有特异性反应。利用这些单克隆抗体建立了检测TSWV的 南部分地区的烟草、辣椒、番茄等田间发病的250份样品进行检测，检测结果表明样品中 验中阳性对照样品能产生一条约777 可靠性用基因测序进一步证实。 mottle 用提纯的香石竹斑驳病毒(Carnation 38kDa的外壳蛋白亚基有 blot分析表明，5株单克隆抗体均与CarMV 效价达10缶。Western CarMV病毒浓度为l ng／mL(绝对检测量为0．1 对田间香石竹样品的检测表明，CarMV在香石竹上发病很普遍。 virus 用提纯的马铃薯X病毒(Potato 髓瘤细胞融合，经筛选克隆，获得2株能稳定传代并分泌抗PVX单克隆抗体的杂交瘤细胞 纯PVX病毒浓度为2 rig)时，