水稻苗穗瘟防卫应相关基因的分离与鉴定.pdf

摘 要 水稻对稻瘟病的抗性存在较大的差异，一些品种不但具有广谱抗性且具有全生育期抗性，而 另一些品种不但对不同瘸原菌小种的抗性反应不同，而且不同生育期对同一病原菌小种的抗性反 应也不同。为了探讨小种特异抗性和生育期特异抗性的分子基础，第一，选用穗期对稻瘟病抗／感 反应差异的一对水稻品系，利用抑制消减杂交(SsH)，分离水稻对穗瘟防卫反应相关基因；第一l， 选用一个具有小种特异抗性的水稻品种，分离水稻．稻瘟病非亲和，亲和互作中差异表达的基因，并 对筛选到的差异表达基因在不同生育期的表达进行了RT_PcR分析。为了进一步研究差异表达基 因的功能，还构建了水稻抗稻瘟病苗期和穗期两个全长cDNA文库。 选用遗传背景相近、对叶瘟抗性相同但对穗瘟抗性不同的两个水稻株系，利用SSH构建穗瘟 抗／感消减cDNA文库，经差异筛选及序列分析，共获得90个独立的差异表达cDNA克隆。利用 R1：PcR分析了26个所筛选到的cDNA克隆在抗，感植株接种后的表达，17个基因的表达差异得到 验证。对这些基因在穗期抗／感植株中接种稻瘟菌后的表达谱进行RT_PcR分析，它们在抗，感植株 中受稻瘟菌感染后或被诱导或被抑制，但在抗／感植株中被诱导和被抑制所发生的时间以及程度不 同。推测Ca2+信号传导途径在水稻防卫穗瘟过程中起着重要的调节作用， 以同一水稻品种中156接种不同稻瘟菌小种，通过SSH构建水稻．稻瘟菌非亲和，亲和互作消 减cDNA文库，结合差异筛选，经序列测定及RT．PcR分析，共获得25个独立的经验证的差异表 达cDNA克隆，并对它们在苗期水稻-稻瘟病菌非亲和，亲和互作早期的表达谱进行了分析，被检测 基因在非亲和，亲和互作零点的表达水平相同．而在接种后，它们的表达发生变化，说明所有这些 变化都是由于接种引起的；在两种不同的互作反应中，大部分基因的表达变化趋势一致，但存在 程度的差异：少数基因表达变化在两种互作中不一致，说明这些表达的变化仅仅与接种的不同小 种有关，肯定了所分离到的基因及其表达变化的可靠性。部分基因在穗期受不同稻瘟病菌小种侵 染后也发生变化，但变化趋势与苗期有所不同。 信息学功能分析表明，苗期和穗期所筛选到的参与水稻稻瘟病防卫反应的基因，都涉及到病 原菌或环境胁迫应答、信号传导、转录、蛋白合成与修饰、代谢、转座等生物学功能。 本研究表明，无论在穗期或苗期，还是寄主特异或小种特异抗性的防卫反应中，大多数参与 水稻对稻瘟病防卫反应的基因在抗病和感病反成过程中都被诱导或被抑制。这些基因可能作为基 础抗性基因参与到防卫反应过程中，但由于它们表达发生变化的时问和程度的差异而导致了抗性 反应的不同；而少数基因在抗，感反应过程巾受病原菌侵染后的表达变化趋势存在较大差异，甚至 呈现完全相反的变化趋势，这些基因可能在抗病反应过程中起主要的调节作用。但苗期和穗期对 稻瘟病的防卫反应存在一定的差异，因此推测，由于一些参与防卫反应的基因不但受病原菌小种 的诱导，而且也受水稻本身生长发育的调节，从而产生了病原菌小种特异抗性和寄主生育期特异 抗性。 关键词：稻瘟菌．穗／叶瘟抗性，小种特异抗性，防卫反应相关基因，抑制消减杂交，水稻 插图及附表清单 2 ssH ．．40 cDNA文库插入片段凝胶分析…………………………………．． 2●2 基于PcR的差异筛选代表性结果…………………………………… ．．40 23 正向和反向文库中差别表达克隆的功能类别百分比比较……………．． ．41 24 部分所选克隆在抗，感植株接种稻瘟病菌后的R丁-PcR表达…………． ．42 2 部分所选到的克隆在抗，感植株中的表达谱分析………………………．． ．43 3 部分差异表达克隆在中156中苗期接种不同小种后的R1二PcR表达谱 —55 3 部分差异表达克隆在巾156中穗期接种不同小种后的RT-PcR表达谱 ．．56 4 总RNA和InRNA