苏云金芽胞杆菌虫基因的鉴定与克隆.pdfVIP

摘 要 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis ，Bt ）是目前应用最广泛的生防微生物。 由于害虫抗性的产生，杀虫谱窄等问题的存在，苏云金芽胞杆菌新型基因的克隆将 为拓宽我国 Bt 杀虫基因的种类，扩大杀虫对象，特别是发现对较难防治的害虫有 效的基因，为培育抗虫转基因植物提供有效的基因资源，也为害虫的抗性治理提供 一种方法。本研究采用 PCR-RFLP 技术对本实验室分离保存的 285 株 Bt 菌株进行 了基因型的鉴定：结果表明这些菌株含有cry1，cry2，cry3 ，cry4/10，cry8，cry9 ， cry11，cry21，cry22，cry30，cry32，cry40 和 vip3A 共 13 类基因。56 株含有 cry1 型基因，45 株含有 cry2 型基因，97 株含有 cry8 型基因，13 株含有 cry32 型基因， 10 株含有 cry4/10 型基因，9 株含有 cry30 型基因，5 株含有 cry22 型基因，含有 cry11 和 cry3 型基因的菌株各 2 株，含有 cry9，cry21 和 cry40 型基因的菌株各 1 株；有 39 株含有 vip3A 型基因；106 株未鉴定出基因型，这些菌株有可能含有未知的基因 型，有待于进一步研究。在基因组合方面，有 12 株含有 cry8C 和 cry8F，5 株含有 cry8E 和 cry8F 基因；发现有 5 株同时含有 cry1Aa，cry1Ea，cry1Be，cry1Ah，cry1Ai ， cry1Ic，cry2Ab 和 vip3Aa 共 8 种基因，杀虫活性也有待于进一步研究。 伴胞晶体的 SDS分析结果表明：同时含有 cry1 和 cry2 型基因的菌株大 部分表达约 130kDa、60kDa 的晶体蛋白，晶体形状多为菱形；含有cry22 基因的菌 株编码约 80kDa 蛋白,晶体为大圆形，且晶体较芽胞大；含有 cry32 基因的菌株多 表达约 130 kDa、40kDa 的晶体蛋白，晶体形状为菱形；含有cry8 基因的菌株大部 分表达约 130kDa 的蛋白条带，晶体形状几乎都为球形。未鉴定出基因型的菌株表 达的晶体蛋白多样，晶体形状也具有多样性。 从菌株 FZ-4 中克隆了全长cry22 基因。菌株 FZ-4 中克隆得到的全长cry22 基因 已在GenBank 中登记，登录号为EU715020 ，并被Bt 基因国际命名委员会正式定名 为 cry22Aa3，是一种新的 cry22 基因，在国内首次发现。 通过对 cry4 和 cry32 基因部分序列的克隆与测序，发现了 4 个新基因。菌株 FBG-133 和 FZ-2 各含有一个新的 cry32 基因，菌株 FBG-133 克隆的部分基因序列 与 GenBank 中已知的Bt 模式基因 cry32Ca1 （AB075461.1 ）的序列相似性最高，相 似性为 86% ；菌株 FZ-2 中克隆的部分基因序列与 Bt 模式基因 cry32Aa1 （AY008143.1 ）的序列相似性最高，相似性为91% 。菌株FBG-25 经克隆得到 1563 bp 的部分基因序列，这部分基因序列只与已知的 cry 模式基因 cry54Aa1(EU339367) 具有序列相似性，相似性为 97% 。菌株FPT-3 经克隆得到 1418bp 的部分基因序列， 通过 NCBI BLAST 分析发现，克隆得到的部分基因序列与 GenBank 中已知的Bt 基 因不存在相似性，推断含有未知的基因，有待于进一步研究。 97 株含有 cry8 基因的菌株中有 3 株对大黑鳃金龟幼虫活性较高，这 3 株菌分别 8 为菌株 Hw-11 、FBG-74 和 FBG-17 ，LC50 分别为 1.0716×10 芽胞/mL 菌液、3.6109 8 8 ×10 芽胞/mL 菌液和 11.5792×10 芽胞/mL 菌液；有 44 株对铜绿丽金龟幼虫活性 较高，其中菌株 FPT-38 和 Hw-2 对铜绿丽金龟的活性最高，14d校正死亡率可以达 到 100%。 106 株