茁霉多糖生产菌的选育及发酵条件优化研究.pdfVIP

茁霉多糖生产菌株的选育及发酵条件优化 摘要 的臆外多糖。该糖秃色无味、茺毒，对入体秃任何副律嗣，其有优良的水溶性、 隧隔氧气性、残膜缝、成纾性、粘缝性和塞然辫勰姓等毒冬多独特静物理纯学翻生 躲特性，可被广泛应雳劐食蒜、医药、纯救燕、耀草耱农娩等领域，并且可黻被 微生物降解，不会对环境造成浮染，是一种具有极大经济价值和开发潜力的多功 能新型生物材料。在国外，藏襟多糖己工业化生产，但周内尚无茁霉多糖产品， 美键是没有赛产越，因j鲤：获联藩霉多糖高产麓是工鼗纯生产的先决条髂。近年来 原生震体融合已成功应蔫予多辩徽生物，毽潦来用予崽芽短梗霉。本研究鏊在采 用双亲灭活塞短楼霉原生质体融合法获取茁霉多糖嵩产蘸，为茁霉多糖工进化生 产提供了具有痘髑价篷熬蘩株。同时薄变雾株鳇发酵条徉傀纯方蘑进行了论述。 pullulans)P和经过紫外诱变得剿的产色素含量相对较少的黼株UV，为出发菌株， 捌备缀生凄傣。分别取经过培莽24小时盼蘸体，用无菌水洗涤薹~2次，并调蕾体 浓度海l萨个向毛。分剐取2mL蘸6000r／min离心收集蘑体，熬入等体积§一巯蒸 加入蠛牛酶、纤维索酶混会液(蜗牛酶：纤维素酶=l：1)在温度为37℃，处理对闻 梵l小时，蔫悬滴法经复糕或稀释量0蓿翡结晶紫染色，取样麓寨蒙生凄体熬形 成情况。此时原生质体形成率赭达100％。在跏l、脒2褥嫩培养基上原生质体的 再擞举较高，尤其在富含甘露醇的RMl培养基上，再生率达64．6％，由此可以着 嶷，本研究方法不仅提高了原擞质体形成率，弱隧也提糍了其再生率。 冀次进行双亲灭活原生戚棒融合研究：取铡备好赡g￥；廉生质体悬浮渡2mL 置予小离心管幸，予SO℃水浴中保温20rain，可使原质体灭活率达10溉。另取 制餐好酶出芽短梗霉p豹艨生旗体悬浮滚4mL在30W紫辫灯下，照射鞭离30cm 豢捧下，磁力搅拌下照射3min，原生质体灭活率达100％。将上述制备好酶灭活 加入新生磷酸钙溶液，轻摇匀厨在37℃恒温水浴中保温5-10rain，6000r／min离 收集原生质体，加入0．6mol／L懿KCl，稀释蜃涂布在RMI平板土。灭活的双亲原生 质体只有通过融合后致死损伤得到互补才能形成融合子，因此，由紫外、热灭活的原 理可以推出在再生培养基上生长如的菌体霹为融合株。将所检出的融合子在基本 培养基上连续传lO代，保存传代稳定的融合子。经融合予的初筛、复筛，从融合 株中筛选出一株茁霉多糖高产菌株RH。 最怎对融合菌株R}{进行发酵条件优化研究，首先采用单医素筛选法设计从碳 源、氮源、无视盐、种子质量、温度、pH、发酵时间等可以用于出芽短梗霉发酵生 产的臀养基质和发酵条件中筛选影响茁霉多糖产量的关键因素。然后采用正交试验 分别对营养基质和发酵条件中各因素之间关系进行评价，得到最佳营养基质和发酵 条件，并用SPSS统计软件进行结果分析。最后确立高产茁霉多糖菌株RH培养条件 为最适碳源是蔗糖，初始蔗糖浓度为10％；最适氮源为酵母膏、(NH4)2S04，初始 浓度为0．2％酵母膏与0．04％(NH4)2S04；最适无机盐是：初始浓度为0．0196的 上述条件培养后发酵液中茁霉多糖含量为73．69／L。较出发菌株提高了9倍。因此 双亲灭活原生质体融合法选育茁霉多糖高产菌株是值得推广的一种选育方法。 关键词：茁霉多糖，出芽短梗霉，灭活，原生质体融合，发酵条件优化 The of Strainsand BreedingPullulan—producing ofFermentationCondition Optimization Abstract extracelluar is Pullulan,all obtained姆fermentation poly濑aceharide usinglungs, Aureobasidiumis to