荔枝采后主要病菌的特性及内生细菌对其防治保鲜研究.pdf

摘要 摘 要 荔枝是中国南方的亚热带名果，也是最不耐贮藏的果品之一。病原菌的侵染及果实 变褐是影响其贮藏期的主要原因。目前对于该病主要是利用化学药剂来防治，而化学防 治存在农药残留、污染环境等缺点，因此，生物防治成为该病防治研究的热点。另外， 由于卵菌二倍体的营养生长特性，采用基因敲除等传统的基因突变方法在卵菌的基因功 能研究中成功率很低，因此研究卵菌基因功能的主要方法是转化内源基因引起该基因的 沉默，目前荔枝霜疫霉缺少高效的分子遗传操作技术，因此在分子水平上的研究进展缓 慢，为此，本文就引起荔枝褐变腐烂的主要病原菌的生物学特性、遗传转化体系及内生 细菌对其防治和保鲜作用进行较为系统的研究，主要结果如下。 荔枝霜疫霉的生物学特性。该病菌的孢囊梗属于多级有限生长，其孢子囊萌发后形 成多种真菌形态，如游动孢子、芽管、孢囊梗及次生孢子囊；其芽孔位于孢子囊一端、 两端或四周，在一个芽孔处可萌发一根、两根或多根芽管，位于基部的芽孔萌发能力较 强。该菌培养35d 后可产生厚垣孢子，培养45 d 可产生大量的卵孢子，培养10 d 时产 生的孢子囊的萌发率最高。孢子囊在温度为16 ~ 24 ℃时萌发形成游动孢子，在26 ℃以 上萌发形成芽管。该菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基 （PDA ）上的产孢量最高，在利马豆 培养基 （LBA ）上的生长速度最快。生长的最适pH 值为6 ~ 8；同时，系统的探讨了环 境因子对该病菌的生长速度、产孢量、孢子囊萌发及侵染的影响。结果表明，该菌生长 及产孢最适的温度为24 ℃，pH 值为 7.0 ；菌丝生长和产孢最适的光照时间分别为20 h 和16 h；该菌孢子囊的致死温度为45 ℃，10 min。另外，不同的温度条件、光照时间、 pH 值和营养成分对其萌发状态和萌发率的影响不同。该菌在pH 值为7 ，光照时间为20 h 的PDA 培养基上培养所产生的孢子囊，在24 ℃条件下萌发率最高。此外，该菌在24 ~ 28 ℃条件下最易侵染荔枝果实，其发病最为严重；超微形态研究表明，该菌可通过孢 子囊及游动孢子从荔枝果皮的嵴点裂缝处与皮孔处侵入，并在果皮内扩展，直到荔枝的 内果皮。通过人工接种实验表明，该菌除了侵染荔枝外，还可侵染水蜜桃。 荔枝酸腐菌的生物学特性。该菌最适宜生长与产孢的培养基为 PDA 培养基，而在 米糠培养基生长速度最慢，其产孢量也最少；生长与产孢最适的温度为20 ~ 28 ℃，最 适的pH 范围为6 ~ 9 ；最适的光照时间为12 ~ 20 h；其分生孢子的致死温度为65 ℃, 10 min ；对于该菌萌发影响条件测定表明，该菌最适宜萌发的温度为24 ~ 32 ℃，光照时间 为20h；另外，对于该菌侵染条件研究表明，该菌最适宜侵染的温度为28 ~ 32 ℃；同时， 通过人工接种实验表明，该菌除了侵染荔枝外，还可侵染胡萝卜、葡萄、番茄、茄子、 黄瓜、龙眼果实等。 荔枝霜疫霉遗传转化体系的构建。荔枝霜疫霉的原生质体制备试验结果表明，该菌 最适的酶解种类为崩溃酶，其最佳的酶解温度为24 ~ 30 ℃，酶解时间为4 h，菌龄为4 d ； 原生质体再生最佳的培养基为利马豆培养基，最佳的渗透压种类为甘露醇，其浓度为0.6 mol ·L- 1 ；再生菌株在利马豆培养基上菌落形态呈白色、圆形、毛毡状，其生长速率、 I 摘要 致病性均与亲本菌株保持一致；同时成功的将GFP基因转入荔枝霜疫霉中，获得转化子， 通过PCR检测证明GFP基因已整合到病菌的DNA 中，但是在荧光显微镜下观察不到荧 光。 荔枝酸腐菌遗传转化体系的构建。荔枝酸腐菌的原生质体制备实验结果表明，该菌 最适的酶解种类为崩溃酶，其最佳的酶解温度为30 ℃，酶解时间为4h，菌龄为1 d ；原 生质体再生最佳的培养基为YEPD培养基，最佳的渗透压种类为蔗糖，其浓度为20% ； 再生菌株在YEPD培养基上菌落为白色，形态呈圆形、表面粉状，其生长速率、致病性 均与亲本菌株保持一致；同时成功的将GFP基因转入荔枝酸腐菌中，获得转化子，通过 PCR检测证明GFP基因已整合到该菌的DNA中，并且在荧光显微镜下观察到发绿色荧光 菌丝和分生孢子。 荔枝采后病原菌内生拮抗细菌的筛选。采用菌丝生长抑制法和孢子囊萌发抑制法筛 选对荔枝霜疫霉、