草莓镶脉病毒中分离物全基因组结构特征及其orfvi基因功能鉴定.pdf

中文摘要 本研究测定了草莓镶脉病毒（Strawberry vein banding virus ，SVBV）中国分 离物的全基因组序列，并依据SVBV美国分离物序列中各ORF 的特征，确定了 SVBV中国分离物编码的6个ORF在其基因组中的准确位置。进一步根据SVBV中 国分离物全序列克隆了6个ORF 的完整序列，为后续SVBV功能基因研究提供了 必需的序列资源。本研究还将SVBV中国分离物中的致病因子ORF VI转入拟南 芥，观察ORF VI对拟南芥症状表型的影响。 1. SVBV 中国分离物全基因组序列的测定及其序列分析 用 CTAB 法从已感染 SVBV 中国分离物的草莓叶片中提取总 DNA ，根据 SVBV 美国分离物已知序列，设计特异性引物分段扩增了 SVBV 中国分离物全基 因组各部分片段，克隆并测序，序列拼接获得 SVBV 中国分离物全长基因组， 基因组长 7838 bp 。将其与花椰菜花叶病毒属其他成员以及 SVBV 美国分离物进 行序列比对，结果发现，SVBV 中国分离物与 SVBV 美国分离物相似性最高，达 86.14%。再根据 SVBV 美国分离物各 ORF 特征，进一步确定了 SVBV 中国分离 物 6 个 ORF 在其基因组中的准确位置，将其与花椰菜花叶病毒属其他成员对应 的各个ORF 进行序列比对，并构建了各 ORF 的系统关系树。 2. SVBV 中国分离物各个 ORF 的克隆 根据拼接的 SVBV 中国分离物全基因组序列，在其编码的各个ORF 上下游 设计特异性引物，分别扩增 SVBV 中国分离物各ORF 的完整片段，克隆并测序， 和拼接的 SVBV 中国分离物基因组序列比较并校对，保存测序正确的各ORF 克 隆。 3. ORF VI 植物表达载体的构建及以根癌土壤杆菌介导转化拟南芥 将SVBV中国分离物ORF VI插入植物表达载体pCAM2300 ，构建重组植物表 达载体pCAM P6 。pCAM P6 以根癌土壤杆菌介导转化拟南芥，经抗性筛选，获 得T0代转基因拟南芥植株。症状观察发现ORF IV转基因拟南芥症状表型与非转 基因拟南芥植株无明显差异。 关键词：草莓镶脉病毒；全基因组；克隆；序列分析；ORF VI ；转基因 I Abstract The complete genome sequence of Strawberry vein banding virus (SVBV) Chinese isolate has been determined in our research. The exact position of each ORF of SVBV American isolate located at the genome was determined according to the characteristics of sequences of each ORFs of SVBV American isolates. Moreover, sequence of six ORFs of SVBV Chinese isolate were cloned according to the complete sequence of SVBV Chinese isolate, and the necessary sequence resources were provided for the following research of function genes. Pathogenic determinant ORF VI of SVBV Chinese isolate was transformed into Arabidopsis