苏云金芽胞杆菌线虫菌株的筛选及其活性因子研究.pdf

独创性声明 本人声明，所呈交的学位(毕业)论文，是本人在指导教师的指导下独立完成 的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答 谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做 出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识 产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位(毕业)论文作者亲笔签名：／余三弋 日期：b矿2，易．，9一 N 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位(毕业)论文的规定，即学校有权 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可 以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位(毕业)论文作者亲笔签名： ，t 日期：沙g。‘．·g 、， 7切 指导教师亲笔签名： 仑L 日期： 中文摘要 化学农药对农业有害生物的防治虽然成效显著，但是由于日益恶化的环境问题，微 生物农药的使用是大势所趋．苏云金芽胞杆菌(Bacillus 应用最为成功的一类微生物杀虫剂，在植物病害防治方面也取得了一定的进展。深入挖 掘我国丰富的苏云金芽胞杆菌资源，分离克隆新型高毒力的杀虫蛋白基因，对构建高效 广谱工程微生物和培育转基因抗虫植物具有重要的理论意义和应用价值． 新秀丽小杆线虫(Caenorhabditis elegans)是蘑菇等真菌上的重要病原线虫，同时 也是一种模式生物，能够在室内培养。本试验采用大肠埃希氏菌饲养，获得大量虫源， 建立了以Celegans为生物测定指标筛选高活力召f菌株的技术路线，成功地筛选 0．从历01 到高效活性菌株厨01 0中克隆表达了两类Br毒性因子：晶体蛋白和 几丁质酶，采用质谱手段证实了几丁质酶的存在．该试验初步揭示了B，侵染线 虫的机制，丰富了曰r侵染线虫过程中的致病毒力因子几丁质酶的性质及其酶基 因，为研究历侵染线虫的机制提供了有益的佐证． 通过生物测定观察线虫对不同厨菌株所产生的毒力反应，发现在118株研中只有 6株对线虫有毒性，作用时间大约在36 h左右，6株中Bt010最为理想，其LC50为0．498 010伴孢晶体以菱形和方形为主，对其基因组进行PCR扩增，发现该茵株 ¨∥“．Bt 的基因组中存在cry lIa，而未见预期含有的cry5和cry6等已知杀线虫的cry基 1I基因保守序列设计简并引物，利用PCR技术扩增出杀虫晶体蛋白基因 因．根据cry 因的表达产物对线虫不产生毒l生作用．提取Bt010的总蛋白进行质谱分析，得到相似 肽段推测其主要成分为几丁质酶．利用光学显微镜观察，Bt010处理线虫后，能不同程 度地降低线虫的活动力，抑制线虫生长，明显破坏线虫体壁的完整性．透射电镜照片清 楚表明Bt010能够有效降解体表层，引起线虫体壁结构的剧烈变化．基于以上结果， 根据几丁质酶基因保守序列设计引物，利用PCR技术从Bt010中扩增到几丁质酶 克隆表达，生测发现该菌对线虫具有一定程度的毒杀作用。Bt010在杀灭线虫的过程 中对线虫DNA不造成损伤，可以作为研安全性实验的辅证。 除了对模式线虫Celegans有活性外，Bt spp．)也有一定的防效，证明该菌株具潜在的应用价值。 本研究的特色和创新主要体现在以下三点： 一．建立了以Celegans生测为指标筛选高活力研菌株的技术路线； 二．采用质谱手段证实了Chiti