一株乳酸乳球菌组菌株抗胁迫能力的研究.pdfVIP

摘 要 乳酸乳球菌被公认为是有益生作用的食品安全级微生物。在其实际应用过程 中，会面临诸多非适宜的生存环境，如低温、高渗透压、恶劣的人体肠道微环境 等。人们已经在不断尝试，以求提高乳酸乳球菌在这些胁迫环境中的抗性，拓展乳 酸乳球菌的应用领域。 前期研究发现，乳酸乳球菌NZ9000 （pFL010 ）中本底表达的谷氨酰胺转氨酶基 因（mtg ）使得细胞壁增厚。基于前期研究，本文首先比较两菌株在酸、低温、胆盐、 渗透压等非适宜环境下的抗胁迫能力差异，再用MTG 竞争性抑制剂—胱胺处理两菌 株，旨在减小细胞壁增厚的幅度，探究细胞壁增厚与重组菌抗多种胁迫能力的内在 联系。实验结果如下： 随着溶氧量的增加，重组菌的生物量（OD600 ）明显提高，15mL 振荡体系中最大 生物量为40mL 体系静置条件下的3.5 倍，是振荡条件下对照菌的4.5 倍，并且在溶 氧量大的环境中重组菌对数期延长至16h。 重组菌发酵后期发酵液pH 接近中性，在pH 5.0 的GM17 培养基中最大生物量为 正常条件下的88.8%。对照菌在pH 5.0 的GM17 培养基中最大生物量为正常条件下 的48% 。对数期和稳定期的重组菌对酸胁迫抗性基本一致，稳定期对照菌的酸胁迫抗 性较强。两菌株对数期细胞经pH3.0-10min 胁迫，存活率差异最大，重组菌是对照菌 的2296.8 倍。延长胁迫时间至2h ，两菌株的存活率均骤降。不添加氯霉素培养菌体 和pH5.0 酸诱导处理，均能增强两菌株的耐酸性。 在 4 ℃低温胁迫下，重组菌有缓慢生长现象，对照菌活菌数逐渐降低几近至零 存活，差异明显。在-20 ℃冷冻胁迫下，重组菌和对照菌存活率变化趋势大体一致， 差异小。 30℃下含5%胆盐的GM17 培养基中，重组菌的生长与对照组（未添加胆盐）的 基本一致，稍低于在37℃下含5%胆盐的GM17 培养基中的生物量。在0.5%胆盐环 境中短时间胁迫2h ，存活率达48.46%±4.02% 。对照菌的生长受胆盐影响很大，耐受 浓度0.01% 。在0.03%胆盐环境中短时间胁迫2h 不生长，在0.02%胆盐浓度胁迫下， 其存活率为57.33%±4.62% 。 在高渗透压条件下，重组菌和对照菌稳定期细胞的生长性能与对数期细胞的相 当。重组菌在含1%NaCl培养基中的长势比对照组（不含NaCl ）的更好，在含4%NaCl 培养基中，重组菌的最大生物量 （OD600 ）是对照条件（不含 NaCl ）下的 77.35%， 对照菌生物量基本没有增长。 对重组菌和对照菌胞内胆盐水解酶活力进行定性检测，结果排除了重组菌对胆 I 盐的耐受性是由于胆盐水解酶存在的可能。40mmol/L 胱胺前处理重组菌后，重组菌 0.5%胆盐胁迫存活率由原来的 48.46%±4.02% 降至 14.2%±1.76%；4%NaCl 胁迫下的 最大活菌数下降了13.55%；用溶菌酶去壁，发现复染成红色时间提前 1h。同条件处 理对照菌几乎没有变化。因此，重组菌耐胆盐能力和耐渗透压能力与自身细胞壁增 厚可能有关。 关键词：乳酸乳球菌重组菌，酸胁迫，耐胆盐，渗透压胁迫，细胞壁 II Abstract Lactococcus lactis has already acquired the status of generally recognized as safe (GRAS), and has been considered as probiotic bacteria which was beneficial to humans.In the practical application, it will face a lot of unsuitable living environments, such as low temperature, high osmotic pressure, bad human intestinal microenvironment, etc. Peopl