四核苷酸重复序恒温扩增特性及基因组中反向重复序列特点的研究.pdfVIP

谨以此论文献给一直关怀与支持我的导师、朋友 及家人！ 陶现明 万方数据 万方数据 万方数据 摘 要 四核苷酸重复序列恒温扩增特性及基因组中反向重复序列特点 的研究 摘 要 简单重复序列广泛存在于多种生物基因组中，同分子进化、基因调控和某些遗传 疾病密切相关，广泛用作遗传标记和遗传作图，其生物学意义越来越受到人们的重视。 研究显示，许多简单重复序列（包括四重复序列）易于扩增变长，某些重复序列的异 常延伸是造成一些遗传疾病的直接原因。然而，对四重复序列扩增特性和机理的研究 报道很少。为系统研究其扩增特点，本研究首先选取了有代表性20 nt 的60 种四重 复和6 种二重复单链，综合探究了它们在嗜热DNA 聚合酶作用下等温扩增的特点。 探讨了反应温度、对应双链模板的Tm、时间、序列、浓度、酶种类等因素对扩增特 点和产物长度的影响。此外，还对非回文单链中部分回文序列对扩增的影响和某些五、 六、七、八重复单链序列的扩增特点进行了简单分析。接下来，以互补非回文四重复 单链混合成的双链和回文序列为对象，简单分析了重复双链扩增的特点。最后，受反 向重复序列(Inverted Repeat ，IR ；Inverrted Repeats，IRs)极大提高重复单链扩增能力 的启示，利用Matlab 编写IR 搜索程序然后，搜索了某些病毒、大肠杆菌和酿酒酵母 基因组序列和人部分染色体片段中的IR ，对其特点进行了分析。 四重复单链扩增结果显示：多数单链模板能扩增变长，即使链内没有互补碱基的 序列也可被扩增，如(AGGA)5 ；非回文单链产物呈弥散条带，回文单链在某些条件 下产物分子量比较集中；回文单链扩增强于非回文单链，前者初始扩增就很快，后者 先慢后快；二重复单链比相同碱基组成的四重复单链有更宽的适于扩增的温度范围； G 和C 含量多的单链较G 和C 含量少的序列更易扩增，而且G 和C 含量越多越适于 在较高的温度下扩增；重复单位含两相同嘧啶的链多数比其互补链更易扩增；70℃下 产物浓度与时间基本呈线性关系。非回文四重复单链在10 nM 以上才会在16 h 内有 明显扩增，而回文序列在低至10 pM 时仍能在短时间内明显扩增；常温聚合酶Klenow 片段不能有效扩增四重复序列，而嗜热聚合酶的扩增活性具有序列偏好性；四重复单 链的有效扩增需要在一定的酶浓度之上，回文序列的必须酶浓度更低。互补序列加入 I 万方数据 摘 要 非回文四重复单链后扩增能力得到极大提高，在 3’端易生成小分子，在 5’端则易生 成大分子。五、六、七、八重复单链的扩增结果显示：回文单链的扩增能力依然很强， 非回文单链的扩增普遍较弱；重复单位与回文序列仅差1 个碱基的非回文序列扩增能 力极大减弱；重复单位中相同的碱基变化对不同序列的影响不同。限制性酶切产物结 果显示，扩增产物与模板具有相同的重复单位，是重复序列的简单延伸。最后，根据 实验结果和相关文献，提出了链内滑动扩增和发卡DNA 介导扩增两阶段的重复序列 单链扩增模型，以对重复序列非特异扩增和相关疾病发生机制的研究提供参考。 四重复双链的扩增结果显示：二重复非回文双链比绝大多数四重复非回文双链扩 增更强，且产物长度随时间增加的趋势更明显；重复序列双链比相应的单链在短时间 （3 h ）内的扩增更快；四重复双链产物也呈弥散条带，某些产物长度随时间递增； 双链模板的最适扩增温度与其Tm 相近，故含GC 多的最适扩增温度更高；G-C 在双 链中的分布影响序列的扩增能力；相同碱基组成的模板具有相似的扩增特点，