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蜂胶黄酮PB3对结肠癌HCT116细胞HSPA6基因表转录水平的影响研究 目的和意义: 物质PB3A（Pinobanksin-3-acetate）是可以从蜂胶、蜂蜜及某些植物花苞等分离纯化获得的一种二氢黄酮化合物，黄酮类化合物具有抗肿瘤、治疗心血管疾病、抗菌及抗病毒、抗氧化自由基、抗炎、镇痛、保肝等生物学活性。 近期本人导师课题组对新疆蜂胶的化学成分进行了系统分离与鉴定，发现了一种二氢黄酮单体成分，淡黄色，密度为1.46g/cm3，HG-U133_Plus_2）技术，通过PB3A干预结肠癌细胞前后的基因表达谱变化分析，探讨该药对细胞内基因表达调控网络的影响，进一步寻找该药作用的靶基因群或关键基因，为PB3A作为抗肿瘤药物开发提供科学依据。 2．国内外研究Awale等人[22]从巴西蜂胶中新分离出3种化合物，其中 (6aR, 11aR)-3, 8-dihydroxy-9-methoxypterocarpan（12.5μmoL/L）对人胰腺癌细胞PANC-1具有很强的杀死作用。Hiroshi Maruta等人[23]研究证明蜂胶具有抑制信号转导因子（PAK1）的作用，PAK1的过度激活与人类70%癌症的发生密切相关。H. Seda Vatansever等人 [24] 通过研究蜂胶乙醇提取物对人乳腺癌细胞系MCF-7 caspase 途径的影响，证明了蜂胶具有抗基因突变和抗癌的医疗作用。Maria J. Valente等人 [25] 研究证明葡萄牙蜂胶对肾癌细胞和正常肾细胞具有选择性的抑制作用，即对肾癌细胞具有强烈的细胞毒性作用，呈浓度依赖性。近期研究发现，新疆蜂胶挥发油对HCT-116细胞具有明显的增殖抑制作用，其机制与其阻滞细胞周期和诱导凋亡有关[27]。黄酮类物质是植物体内存在的多酚类物质，具有广泛的生物学活性，而且对人体正常细胞和组织几乎没有副作用[28-29]。 2005年，依米提·热合曼等人（本人指导老师）从蜂胶甲醇提取物的醇溶性组分中分离了PB3A，对肿瘤细胞增值具有抑制作用的活性物质，并通过光谱分析阐明了该物质的分子量和化学结构。研究发现该物质对人白血病Jurkat细胞具有明显的增殖抑制作用，并随着浓度的增加和作用时间的延长，Jurkat细胞的增殖抑制率逐渐升高，表现为时间和剂量依赖性。 3.研究内容μg/mL PB3A干预和非干预24h后的HCT116细胞总RNA，应用Affymetrix人类全基因组表达谱芯片检测基因表达谱的变化，生物分子功能注释系统鉴定差异基因功能，筛查PB3A诱导HCT116细胞的相关差异表达基因，用图像分析软件对扫描图像进行数字化处理和分析， 生物分子功能注释系统（MAS 3.0）鉴定差异基因功能，并制作基因通路相关性网络。 蜂胶黄酮PB3A对结肠癌HCT116细胞HSPA6基因转录水平的影响 试验总技术路线 结肠癌细胞HCT116[±PB3A(100μg/mL)] ↓ 提取基因组总RNA ↓ 反转录合成cDNA ↓ 设计合成引物 ↓ qRT-PCR扩增（内参和目的基因） ↓ 检测HSPA6基因mRNA转录水平 ↓ PB3A对HCT116细胞HSPA6基因转录水平的影响 细胞培养 1.复苏 从液氮中取出冻存管、迅速置于温水中（37℃） ↓ 1000rpm离心10分钟，弃去上清液 ↓ 沉淀加10ml培养液，吹打均匀，再离心10分钟，弃上清液 ↓ 加培养液，将细胞转移至培养瓶中，37℃培养 2.传代 向瓶内加入胰蛋白酶液1ml，置于37℃孵箱进行消化 ↓ 培养瓶放在倒置显微镜下进行观察，当发现胞质回缩后，立即中止消化 ↓ 吸出消化液，向瓶内用滴管加入培养液少量，轻轻转动培养瓶 ↓ 吸取瓶内培养液，吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液 ↓ 将准备好的细胞悬液转入离心管中，离心(1200r／min) 6min ↓ 弃上清用PBS洗两遍，加入培养液 ↓ 2ⅹ10.4个／ml 浓度接种培养液中培养 3.冻存 消化细胞，将细胞悬液收集至离心管中 ↓ 1000rpm离心10分钟，弃上清液 ↓ 沉淀加含保护液的培养液，计数，调整至5×10.6 ↓ 将悬液分至冻存管中，每管1 ml ↓ 将冻存管口封严，贴上标签，写明细胞种类，冻存日期 ↓ 按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟）→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－30℃ 1小时）→气态氮（30分钟）→液氮。 TRIzol法抽提取细胞总RNA 细胞1×10.7 加1mlTRIzol ↓ 用1ml加样器吹至液体澄清且无细胞团块 ↓ 加氯仿1/5体积(0.2ml)(必须按总体积的1/5) ↓ 颠倒混匀10下，室温5分钟 ↓ 4℃，离心12000g，15分钟 ↓ 转上层水相(约400μl)于另一1.5mlEP管中 ↓