限制性内切酶介（remi）玉米大斑病菌的遗传转化及其转化子表型分析.pdfVIP

摘要 玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum)是一种世界性分布的重要丝状病原真菌， 由其引起的玉米大斑病是一种重要的叶部病害，流行年份造成严重的经济损失。7解 病菌的致病分子机理对其病害的有效防治具有重要意义。众所周知，鉴定病菌致病相 关基因是了解病菌致病机理的关键，许多致病相关基因足通过DNA插入产尘致病缺 陷突变而分离得到的。限制酶介导整合转化(restriction integration， enzyme．mediated REMI)J下被越来越多地应用于丝状真菌致病相关基因的标记与克隆， 本研究通过在优化转化体系中的主要参数的基础上。建立了玉米大斑病菌的 REMI转化体系。结果表明，玉米大斑病菌菌体的培养时fuJ、细胞壁降解酶的种类、 酶解时间、酶解温度以及再生培养基等一系列囚素对原生质体释放及再生有明显的影 响。根据研究结果规范出一套标准化的玉米大斑病菌原生质体制备方法：即(1)从PDA 固体培养基上培养15d的菌落上洗下病菌的分生孢子；(2)将孢子按浓度105个／mL接种 下酶解4--5h：(4)将酶解好的原生质体的酶解溶液用3层擦镜纸的过滤：(5)用已灭菌的 0．7M 沈涤2次后得到所需浓度的原生质体。一般100mL苗丝培养液可以得到浓度为1．44x106 个／mL的原生质体． 共获得T215个玉米大斑病菌转化子。将这些转化菌株于PDA上培养5代(无性繁殖)， 发现所有转化子各子代均能在含50flg／mL潮霉素的PDA培养基上生长，两野生菌株 01·23不能生长，说明转化子在遗传上是稳定的。对这些突变体的基因组进行TPCR 扩增，发现所有参试基因纽中都能扩增到湖霉素磷酸转移酶基因(^咖)序列，表明突 变体的基因组中确实己经携带hph基因序列。经对所得的215个转化子进行尘长速度和 产孢量测定，发现3个转化子的产孢量低于野生菌株01．23。其中转化子M25己旋失产 孢能力，对转化子M25进行致病性分析，发现其致病性减弱。此外，有3个转化子的 产孢量较野生菌株升高。对所有转化子在PDA上生长速度的测定，结果发现5个转化 子的生长速度和野生菌株相比有不同程度的减慢． 关键词：玉米大斑病菌：原生质体制备：REMl转化；转化子表型分析 GeneticTransformationand ofTransfcInnantsof PhenotypicAnalysis REMI．MediatedExserohilumturcicum Author：LIULi．hua Jin-gan Supervisor：DONG Major：PlantPathology Abstract NorthemcomIeaf isoneofthe leafdiseasesinmaize．caused blight important by Exserohilumturcicumwhichisan filamentousandcallleadtodestructive important fungus tocorninthe is tounderstandthe ofthe damage epidemicyears．Itnecessary pathogenesis for anddisease well—knownthat the