最新第五章分子生物学研究法基因工程.ppt

* 第五章 分子生物学研究法 八. 基因工程 基因工程的主要内容: 从生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。 载体的选择, 将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选 择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增殖。 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞。 在寄主细胞中表达外源蛋白。 第五章 分子生物学研究法 八. 基因工程 基因工程的基本操作程序的四个过程: 目的基因的获取 基因表达载体的构建 目的基因导入受体细胞 目的基因的检测与鉴定 第五章 分子生物学研究法 目的基因的获取 生物材料 mRNA 限制性内切酶 一定大小范围DNA片段 cDNA 反转录酶 基因组文库 cDNA文库 基因文库 p. 183 人工合成 获得目的基因 DNA PCR 1. 目的基因的获取 第五章 分子生物学研究法 目的基因的获取 目的基因的获取: (RT)- PCR扩增 基因文库 化学合成法 DNA片段 cDNA片段 基因组文库 cDNA基因文库 第五章 分子生物学研究法 载体构建 2. 基因表达载体的构建 1) 基因表达载体的选择 2) 目的基因与载体的连接 第五章 分子生物学研究法 载体的构建 图: EcoR I 和Pvu II 双酶切质粒载体 和目的基因及目 的基因与载体的 连接。 * 这种连接方式称为 取向退火形成重组 DNA分子。 Pvu II 载体末端 载体末端 目的基因 插入的目的基因 Pvu II 第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 3.目的基因导入受体细胞 1) 原核生物的人工转化（细菌转化） 感受态 (competence) 细菌容易吸收外源DNA时的生理状态。 在自然界中不是所有细菌都能够吸收DNA 也不是任何生长阶段都具有吸收DNA的能力 第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 研究发现： 细菌的感受态是可以诱导的，而且此时细菌摄取DNA 是非选择性。 可通过电击法或CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂处理细 胞, 使细胞膜的通透性发生暂时性的改变,容易接受外界 DNA, 这类细胞被称为感受态细胞 (competent cells)。 第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞  原核生物的人工转化（细菌转化） 是指细菌的感受态细胞接收外源DNA而获得了新的遗传 性状的过程。 第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 （1）转化方法 CaCl2转化法 用CaCl2处理受体大肠杆菌细胞得到感受态细胞。 操作方法: 感受态细胞 +带有目的基因的质粒载体在 42?C, 处理1-2 min；然后冰浴中 2 min。 第五章 分子生物学研究法 目的基因导入受体细胞 优点: 简单、稳定、可重复性高。 缺点: 转化效率稍低，每微克DNA产生106-107转化子