最新第六章表达.ppt

人工脂质体法 3.基因枪法 该法依靠携带了核酸的高速粒子而将核酸导人细胞内，这种方法适用于培养的细胞和在体的细胞。 需要注意的是，没有一种方法是万能的，应根据具体情况进行选择。但无论选用何种转染方法，DNA的质量和数量对转染成功与否至关重要。用于转染的质粒DNA必须没有蛋白质。RNA和其它化学物质污染，可用CSCL梯度离心、柱层析法或质粒DNA提取试剂盒制备DNA。吸光度A260nm与A280nm的比值应在1.8－1.9之间。转染前用乙醇沉淀DNA，再加人适量灭菌水或TE缓冲液溶解DNA，至终浓度为1mg／ml左右。对于不同的细胞，质粒DNA转染所需的量不同，因此在实验开始以前需要优化实验条件。需要优化的参数主要有：脂质体与DNA的比例，转染DNA的总量，细胞接触脂质体的时间及是否存在血清等。细胞状态、密度、传代次数及污染也会影响转染效率。 三、外源基因导入真核细胞的基本方法 近年来，基因导入方法不断改进，使得转染效率逐渐接近100％，将外源基 因导入真核细胞的方法有2类。 （一）病毒感染（Virus infection） 是一种将外源基因导入细胞的天然方法。 （二）质粒转染（Transfection）用非病毒的理化方法将外源基因导入真核细胞的方法称转染。 电穿孔技术 1．病毒感染 物理方法 基因导入方法 显微注射技术 2．转染 化学法 DEAE－葡聚糖转染 磷酸钙共沉淀法 脂质体介导法 醋酸锂法 ? 四、外源基因在真核细胞中表达的主要方式 （一）?? 按外源基因在真核细胞中表达时间的长短分为： （二）按外源基因在真核细胞中表达方式的不同，可以分为： 1.分泌表达 2. 非分泌表达 3. 融合表达 4.非融合表达 （三）克服外源基因对宿主细胞的毒性 建立可调控的诱导型表达载体，给一定浓度的诱导药物，可避免外源基因产物的毒性，建立稳定的转染细胞株。如：四环素诱导表达系统和蜕皮素(Pnasterone)诱导表达系统。 瞬时表达（转染） 稳定表达（转染） 目的 快速分析 为获得稳定表达外源基因的单细胞克隆 目的DNA 宿主染色体DNA 未整合 整合 表达维持时间 随细胞分裂而稀释至丢失 48－72小时 随宿主细胞本身基因组一样复制，转录，翻译，并被稳定遗传 筛选办法 抗生素抗性 抗生素抗性 五、外源基因在真核细胞中表达产物的鉴定和纯化 检测水平 方法 1．mRNA Northern blot 2．蛋白质水平 PAGE Western blot 3．分泌型表达 收集上清－浓缩－纯化 ???第五节? 克隆基因在哺乳动物细胞中的表达 ? 哺乳动物细胞是最理想的表达人类基因的系统，应为首选。 一、哺乳动物细胞表达载体有2大类：质粒型载体和病毒型载体 （一）质粒型载体 哺乳动物细胞质粒型载体大多数是通过细菌质粒而获得的，主要是在质粒的基础上插入了一些病毒或其他一些物种及人的基因表达调控序列。目前有多种质粒载体可供选择。 1. 哺乳动物细胞质粒表达载体的结构 典型的哺乳动物细胞表达载体需要以下顺式作用元件: (1)启动子，(2)多聚腺苷酸化信号，(3)选择标记和(4)几个原核作用元件，如细菌抗生素选择标记(Ampr)和用于质粒扩增的复制子（具有原核作用元件才能作为原核细胞和真核细胞之间的穿梭质粒）等。 （1）启动子：在哺乳动物细胞质粒载体中，常用的启动子种类及其强度见下表，需要注意的是，在不同