猪下丘脑——垂——甲状腺轴五个关键基因的研究.pdf

摘要 候选基因鉴定法是分析数量性状基因的重要方法。本论文以在机体物质与 能量代谢、个体生长发育调控中发挥重要作用的下丘脑．垂体．甲状腺轴五个关 键调控基因：促甲状腺激素释放激素前体TRH基因、促甲状腺激素释放激素受 体TRHR基因、组成促甲状腺激素的糖蛋白激素共同亚基CGA基因和促甲状腺 激素p亚基TSHB基因，以及促甲状腺激素受体TSHR基因为研究对象，应用生 物信息学、辐射杂交细胞系定位技术、3RACE、实时荧光定量RT-PCR、 QTL分布分析、oDNA克隆、组织表达谱分析、遗传多态寻找以及与猪主要经 济性状的关联分析研究，以期了解I--IPT轴该五个关键基因的分子生物学特性， 并为猪主要经济性状遗传改良和标记辅助选择提供科学依据。实验主要得出以 下一些结果： (1)应用生物信息学和辐射杂交细胞系定位技术，HPT轴五个关键基因 分别被定位于猪13、4、1、4和7号染色体。根据QTL数据库查询结果，五个 基因全部位于日增重、肌肉品质和脂肪性状相关QTL内，提示猪HPT轴基因 多态与个体生长速度、肉质和脂肪性状差异可能存在重要关联，为相应QTL的 位置功能候选基因。 (2)本论文首次克隆获得猪TRHR基因mRNA序列，并在分子水平上进 功能性转录本外，本论文实验中还发现了另外两种转录本类型。其中，转录本 2为功能转录本l的截断型，仅含N端结构、跨膜螺旋1．5及部分胞内环3序 列，缺失跨膜域6和7以及蛋白C端结构：而转录本3则恰与转录本2相反， 剪切661 bp的选择性剪接内含子后，使之缺失了TRHR蛋白的N端编码序列， 但保留有C端编码序列。然而选择性内含子的剪接，破坏了原阅读框，转录本 3可能编码一种新的功能蛋白，也可能使用了不同的翻译起始位点。多种转录 本存在的意义有待研究。 (3)采用荧光定量RT-PCR技术，检测了HPT轴五个关键基因在大脑、 下丘脑、垂体、心、肝、脾、肺、肾、甲状腺、胰、胃、小肠、大肠，以及肌 肉和皮下脂肪共15个组织中的表达分布。HPT轴激素及其受体在外周组织， 如皮下脂肪中的共表达，提示相应激素可能通过旁分泌或自分泌方式对局部组 织进行着生长发育调控。 (4)以金华猪和皮特兰资源家系亲本个体为模板，共设计17对引物扩增 HPT轴五个关键基因总长11，340bp的DNA序列，进行PCR再测序以寻找核 苷酸多态变异。分析基因测序峰图，共发现37个多态座位，其中位于TRH基 因多态座位8个，TRHR基因多态座位7个，CGA基因多态座位14个，TSHB 基因多态座位5个，TSHR基因多态座位3个。检测到的所有多态座位都提交 到了国际SNP数据库dbSNP，并获得SNP登录号。根据多态座位彼此间距离 间隔、侧翼序列特点及其潜在功能重要性，选择了其中20个座位，采用 PCR-RFLP和四引物ARMS-PCR技术设计并优化了分型方法。 (5)对49头纯种金华猪和24头纯种皮特兰猪进行唧T轴20个多态座位 的分型，并采用HapBlook软件进行基因单倍型块分析和标签SNP选择。除TRH 基因SNP在金华猪中分布于两个单倍型块外，其他基因的SNP座位均位于同 一单倍型块中。结合两个品种的单倍型区块和标签SNP集合信息，共选择了3 源家系中进行HPT轴基因多态遗传效应分析。 (6)在金华猪与皮特兰资源家系共463头个体中分析了}玎)T轴基因多态 性与猪生长、胴体和肉质共30个主要经济性状的关联性，并在在约克夏、杜洛 克、长白猪以及嘉兴黑猪中进行了一定的验证分析。分析结果显示： s9325994933与个体生长发育后期，尤其是 1)在金皮资源家系中TRH 150．180日龄期间增重有显著关联，其在国内和国外猪种中的基因频率亦存在明 显的对立分布差异，但在生长敬慢的金华猪中占优势的插入突变却在资源家系 中表现为生长优势。本研究认为TRH基因可能在中外猪种生长性状差异形成中 有一定影响，是相关日增重QTL下的位置功能候选基因，但其多态座位效应仍 有待进一步挖掘验证。 2)TRHR基因多态性的种群间分化较大。在金皮资源家系中，其对个体头 重和胴体长有极显著效应，对眼肌的导电率、pI-I值、系水力、肌内水份和肌内 脂肪性状有显著影响。TRHR基因与多项肉质指标存在显著关联，且在肌肉组 织中有表达，本文认为有必要对TRHR基因在猪肌肉组织中的功能进行深入研 究。 3)尽管本文发现CGA