肉仔鸡小肽转运体的克隆表达及其转运调控研究.pdfVIP

摘要 本课题研究了肉鸡小肽转运载体不同肠段的发育及分布规律，并克隆，表达、纯化了肽转运 载体C端抗原表位区，同时建立了肉鸡肽转运载体cPEPTl外源表达的293．T细胞模型、研究了 激素和调节因子对细胞模型中小肽转运载体的调控作用。 试验一荧光定量PCR检测肉仔鸡肠道肽转运载体cPEPTlmRNA方法的建立t根据鸡肽转 运载体cPEPTl 度及退火温度等条件的摸索进行了试验条件的优化， 试验二实时定量PCR评定肉鸡小肠PEPTlmRNA基因发育变化：分析不同日龄肉仔鸡小 肠不同肠段肽转运载体PEPTlmRNA的发育规律。选用1日龄商品代雄性Arbor Acre(AA)肉 鸡100羽，随机分为5组，采用实时定量PCR法研究肉鸡肠道表达的肠段差异；以9、18、27、 rnRNA的表达丰度从十 transporterl，PEPTl)mRNA表达发育变化。结果表明：AA肉鸡PEPTl 二指肠、空肠到同肠依次降低；AA鸡PEPTlmRNA在十二指肠及空肠发育规律表现出相反趋 高，显著高于9、18日龄丰度。 鸡小肠不同肠段肽转运载体PEPTlmRNA的发育规律。选用1日龄雄性商品代北京油鸡100羽， 龄北京油鸡十二指肠、空肠、回肠样品为模板研究肉鸡肠道肽转运载体lmRNA表达发育变化。 结果显示： mRNA的表达丰度从十二指肠、空肠到回肠依次降低；北 (1)北京油鸡肠道PEPTl 京油鸡PEPTlmRNA在十二指肠与空肠、回肠发育规律不同，十二指肠18、36日龄丰度较高， 时PEPTl 则高于18、36日龄，但结果不显著；回肠PEPTlmRNA表达量以72日龄时最高，54、72及90 日的表达量龄显著高于18、36日龄时的表达量。 基因。测序结果证明测序和方向均正确，该基因通过基因序列分析包括12个跨膜区一个较大的 亲水环，抗原表位区集中于蛋白的C端。 试验五鸡PEPTl抗原表位基因的原核表达及序列鉴定：表达并纯化鸡肠道肽转运载体 步的鉴定，所得产物经质谱分析其序列正确。 试验六鸡肠道肽转运载体抗原表位基因毕赤酵母表达系统的构建：根据GenBank发布序列 酸序列，设计一对PEPlrl抗原表位区段外源表达的PCR引物，利用已得到得的全长目的基因 I和Not (2145)pEASY-T3-PE阿1载体为模板，设计酶切位点为EcoRI，扩增出目的片断。将 该片段克隆到pPIC9K载体，通过重组质粒酶切验证、菌落PCR鉴定，证明得到的阳性重组质粒 含有目的基因片段，抗原表位区1000bp，。将抗原表位区基因克隆到毕赤酵母分泌型表达载体 正确。 同时建立了绿色荧光蛋白的共转染体系，通过对HEK293．T的生长条件优化，确定了最佳转化时 间及转化条件，为建立细胞模型建立了基础。 试验八北京油鸡肠道肽转运蛋白PEPTl基因表达载体在293．T细胞的表达鉴定：本试验通 酸序列，成功获得到测序正确的2145bp的基因，并将北京油鸡肠肽转运载体PEPTl基因克隆到 细胞，抽提转染细胞总RNA，DNAse I处理残留的DNA污染，反转录合成cDNA，以构建不同 44h均有稳定的转录水平。从而建立了在293．T细胞表达北京油鸡PEPTl的外源模型。 试验九北京油鸡肠道肽转运蛋白PEPTl基因表达载体在293-T细胞的转运调控：通过克隆 细胞，每孔质粒添加量lug，Real—Time 抽标定的甘亮肽孵育液，孵育液中添加旷、GH及胰高血糖素，分别在30、60min中止反应， 液闪仪测定孵育液放射性。结果：用Real—Time 达细胞中，与矿及胰高血糖素相比，生长激素添加有效的促进了表达细胞对甘亮肽的吸收。 关键词：鸡，肽转运载体，基因表达，调控 Ⅱ Abstract Nine wereconductedto themechanismof and