脂多糖(lps诱导绵羊肺泡巨噬细胞cdna文库的构建、est分析和免疫相关基因的研究.pdf

脂多糖LPS诱导绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建、EST分析和免疫相关基因的研究 摘 要 脂多糖(1ipopolysaccharideLPS)是革兰氏阴性细菌胞壁外膜中的一种生物活性成 分，在革兰氏阴性细菌感染的发病机制中起十分重要的作用，能够刺激机体免疫系统， 诱导炎症反应，而且作用于抗原提呈细胞，参与诱导抗感染的特异性免疫应答，是早期 免疫应答反应的最强刺激剂。本项研究旨在构建LPS诱导的绵羊肺泡巨噬细胞eDNA文 库，为绵羊免疫相关功能基因研究提供基础平台；监测免疫相关因子(细胞因子、TLR 受体和防御素)基因对LPS刺激的应答反应规律，探讨其参与机体抗感染免疫的分子机 制；通过基因工程表达相关功能基因并鉴定其生物学功能，为开发免疫佐剂和治疗性药 物奠定基础。 目前，绵羊各种组织类型的eDNA文库数量还很少，可为绵羊基因组研究提供的遗 传标记很有限，导致绵羊基因组物理图谱研究较其它家畜如牛、猪等研究相对滞后。绵 羊功能基因的研究主要集中在经济性状相关基因，对抗感染免疫相关的因子研究很不充 分，绵羊细胞因子、toll样受体和防御素的表达分布、与病原感染之间的关系以及自身 之间相互调节的联系都还不清楚，其表达调控的分子机制对研究疾病的病理过程具有重 要意义，有必要进行深入的研究和探讨。 本研究通过气管灌流法从绵羊肺脏分离培养原代肺泡巨噬细胞，利用台盼蓝拒染试 验和鸡红细胞吞噬试验对其进行形态学观察和鉴定，运用SMART技术构建LPS诱导的绵 建立荧光定量PCR检测方法，动态监测LPS诱导绵羊肺泡巨噬细胞过程中细胞因子、toll 在绵羊不同发育阶段的表达分布及表达差异。建立沙门氏菌感染绵羊消化道模型，检测 防御素sBDl和IL一8对沙门氏菌感染的应答反应，对其抗感染生物学功能进行研究；构 建重组绵羊GM—CSF表达质粒电击转入酵母细胞，通过甲醇诱导绵羊GM-CSF分泌表达。 构建原核表达载体在大肠杆菌中融合表达绵羊防御素sBDl，并对其进行抗菌活性检测。 初步获得以下结果：(1)构建了脂多糖LPS诱导的绵羊肺泡巨噬细胞全长eDNA文库，其 后4—12h表达水平最高，IFNl III 脂多糖LPS诱导绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库的构建、EST分析和免疫相关基因的研究 肺泡巨噬细胞中没有表达，其主要在呼吸道和消化道组织中表达，而且是持续表达的， 其在不同发育阶段消化道表达水平高低为羔羊成年羊胎羊。在感染沙门氏菌实验中 IL一8明显升高，而防御素sBDl表达反而有所降低；(4)在毕赤酵母中诱导表达绵羊 GM—CSF，其表达量占总蛋白17％；在大肠杆菌中融合表达了绵羊防御素sBDl，但未表现 出抗菌活性。 以上结果表明，本研究成功地构建了脂多糖LPS诱导的绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文 库，该文库为国内首个绵羊肺泡巨噬细胞cDNA文库，从对文库克隆的序列分析来看， 新的EST和未知功能的基因约占20％，丰富了绵羊基因组物理图谱的遗传标记。另外， 该文库是革兰氏阴性菌主要抗原组分脂多糖刺激巨噬细胞cDNA文库，为免疫相关的功 LPS刺激表现出时间和表达量的差异为阐明疾病病理状态的分子机制提供了科学依据， toll样受体3、5和防御素sBDl在脂多糖刺激肺泡巨噬细胞中并不表达，说明肺泡巨噬 细胞可能并不是其表达部位，toll样受体2、4对脂多糖LPS刺激的敏感性很高，说明 它们参与早期的免疫应答反应，在革兰氏阴性菌感染中发挥重要作用；防御素sBDl在 粘膜系统中广泛分布，并且持续表达，表明其在粘膜天然免疫中一定发挥着重要作用， 但其对沙门氏菌感染没有反应，可能是由于其并不直接参与抵抗细菌感染，而与其它类 型病原感染有关，而IL一8明显参与了消化道对沙门氏菌的抗感染免疫；绵羊GM-CSF参 与早期的免疫应答，并且在疫苗佐剂和治疗性药物表现出良好应用前景，本研究在酵母 中表达绵羊GM—CSF为进行开发和应用提供材料；防御素sBDl在粘膜系统广泛分布，但 其生物学功能却不清楚，通过大肠杆菌融合表达绵羊防御素sBDl，为其生物学功能研究 奠定基础。 关键词：绵羊肺泡巨噬细胞，eDNA文库，细胞因子，防御素，实时定量PCR IV Abstract a