鸭疫里默氏杆菌病相关因子研究.pdfVIP

摘 要 鸭疫里默氏杆菌致病相关因子研究 特种经济动物饲养专业博士研究生 李继祥 指导教师 周泽扬教授 摘要 鸭疫里默氏杆菌是一个多宿主的病原菌，除主要引起家鸭的渗出性炎症以外， 还感染鹅、鸡、火鸡、鸽子、野鸭、鹦鹉等其它鸟类，甚至已从猪、青鱼体内分 离鉴定出该细菌。目前鸭疫里默氏杆菌已成为危害养鸭业的主要病原之一，呈世 界性流行趋势，发病率和死亡率一般为10．30％，但部分鸭场达95％以上。该细菌 的危害除引起动物发病、死亡外，还因感染耐过动物饲料转化率低、生长发育迟 缓造成严重的经济损失，甚至由于抗菌药物的大量使用而引起食品安全问题。自 1982年以来，尤其是在东亚和东南亚地区，鸭疫里默氏杆菌感染严重制约了肉鸭 的集约化养殖。 鸭疫里默氏杆菌血清型复杂，各血清型菌株间缺乏交叉免疫保护：极易产生 耐药性，流行菌株多表现为多重耐药。关于其致病相关因子尚不明确，而对于致 病机制的研究处于起步阶段。作者在研究鸭疫里默氏杆菌液化明胶菌株的流行病 学特征的过程中发现，鸭疫里默氏杆菌液化明胶特性与致病性有关。基于此，本 文以液化明胶活性成分(明胶酶)为对象，研究鸭疫里默氏杆菌的致病相关因子， 为进一步研究细菌的致病机制奠定基础。 1．鸭疫里默氏杆菌流行菌株的分离鉴定及液化明胶特性测定 利用巧克力营养琼脂平板从2004．2008年收集于重庆、四川等25个地区的661 份疑似鸭疫里默氏杆菌感染的自然病例中分离、鉴定出548株鸭疫里默氏杆菌， 其中512株对10日龄鸭具有毒力，25株细菌经鸭体内传1．3代后获得毒力，11株 在鸭体内传7代仍不具有毒力。利用明胶．营养琼脂平板和明胶．琼脂平板分别测定 细菌及培养滤液的液化明胶特性，有毒力的537株细菌及培养滤液都能液化明胶， 占分离菌株的98％；不具有毒力的11株细菌及培养滤液不能液化明胶，占分离菌 株的2％。鸭疫里默氏杆菌液化明胶特性稳定，液化明胶和不液化明胶菌株在巧克 力培养基和鸭体内分别传30和10代后未发现明显的变化。液化明胶的鸭疫里默 氏杆菌培养滤液的明胶酶谱呈现6条活性带，不同菌株各谱带的活性存在差异， 且各谱带活性能被EDTA抑制。 2．鸭疫里默氏杆菌产明胶酶的条件优化及酶的分离纯化 T 两南大学博十学何论文 本研究在建立定量测定鸭疫里默氏杆菌明胶酶活性的基础上，对鸭疫里默氏 杆菌产酶条件进行了优化。研究结果表明，产酶培养基的基本组成为2％蛋白胨、 的产生；最适培养温度为37℃，在振荡条件下的最适培养时间为24h。 在最佳条件下培养AF株细菌，培养滤液经分子截流量为10kDa超滤膜浓缩、 Fast Flow阴离子交换层析、 最终饱和度为70％硫酸铵盐析、DEAE．Sepharose phenyl—sepharose 液化明胶活性的蛋白质组分(明胶酶)，活性回收率为28．4％。分离纯化的明胶酶 培养滤液的第5活性条带一致。 3．鸭疫里默氏杆菌明胶酶的生物学活性研究 本研究利用鸭胚成纤维细胞和10日龄雏鸭模型对分离纯化的鸭疫里默氏杆菌 明胶酶的生物学活性进行了研究。明胶酶对鸭胚成纤维细胞具有细胞毒性，半数 致细胞形态发生异常，主要表现为细胞膜降解、细胞质丧失与细胞核浓缩。对30 株鸭疫里默氏杆菌临床分离株的培养滤液检测发现，具有毒力及能液化明胶的27 株细菌均能引起与明胶酶一致的细胞形态变化，而无毒力及不液化明胶的3株细 菌的培养滤液不表现细胞毒性。 明胶酶对雏鸭具有毒性，能增强鸭疫里默氏杆菌对动物的侵袭力，增加菌血 症的严重程度，缩短感染潜伏期和致死动物的时间，显著提高动物的死亡率。颈 用不明显。发病动物主要表现嗜睡懒动、腿软无力、甩头、张口呼吸及头颈歪斜 等症状；死亡动物有肝脏轻微肿大、硬脑膜有出血点、大脑水肿等大体病理变化。 在组织学上，2000U／ml作用8h鸭的心肌纤维肿胀变粗、横纹不明显，纤维间质水 肿、可见微细颗粒和空泡；肝细胞索不规则，肝血窦变小，肝