实验五动物细胞培养与细胞活性检测要点.pptVIP

实验五　动物细胞培养与活性检测 实验目的 了解动物细胞培养的基本知识。 了解体外培养细胞的的基本形态类型；学会通过镜检判定体外细胞生长的状态。 了解动物细胞的复苏、传代培养和冻存的基本方法。 掌握动物细胞的活性检测基本方法。 实验原理 细胞培养（Cell culture）是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。 原代培养：直接从供体取来的细胞，组织或器官进行的初次培养。通常把 第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 传代培养：原代培养物长成单层细胞，达到一定密度时，营养消耗殆尽，需要补充营养，分开扩大培养，使之继续增殖。注意的是传代的这个“代”与细胞分裂的一个世代不同，一代细胞约分裂3~5次，不要混淆。 动物细胞培养的基本条件 体外培养细胞的条件总原则就是要尽可能模拟细胞在体内生长的环境，因此必要的营养、适宜的胞外环境以及严格的无菌条件是主要的三个方面。营养：早期培养主要采用天然的生物性液体，但其成分不确定，难以控制营养成分。现广泛使用的是化学成分明确的各种商品化的合成培养基，其主要成分包括各种氨基酸、维生素、无机盐、葡萄糖等必要的营养物质。培养基中还含有酚红指示剂，使培养基的颜色可显示细胞生长状态。随着细胞数目的增长，酸性代谢物增多，培养基变黄。污染的培养物也会使培养基迅速变黄。 　　 培养基在使用前还要加血清，它的主要作用有三点：一是提供生长因子、激素、酶等营养；二是中和有毒物质，对细胞起着保护作用，尤其可中和培养中使用的胰蛋白酶的毒性。第三是提供黏附和伸展因子，是贴壁细胞附壁生长所必不可少的。所以，血清的品质对细胞的生长有很大影响，通常换用新的批次的血清，要预先进行血清的筛选实验。 一般进口的胎牛血清更有利于细胞的生长，但价格较昂贵，可根据培养细胞的要求选用。另外，有些细胞培养中还需要添加谷氨酰胺Gln胞外环境条件：主要是温度、气体和pH条件。这些胞外环境条件应该符合细胞在体内的生长环境。 哺乳动物适宜的培养温度是37℃，鸟类是39℃，爬行类是22～25℃等；大多动物细胞适宜的pH条件都7.2～7.4，以不超过pH6.8～7.6，为宜。在动物细胞培养过程中随着代谢产物的积累，酸性产物增多。培养基的pH会下降。因此实验室通常使用CO2气体体积占5%的空气作为细胞培养的气体条件，以使CO2溶解在溶液中形成NaHCO3和H2CO3的缓冲体系，维持pH的稳定。另外，培养基中加入HEPES（羟乙基哌嗪乙烷磺酸）可更有效的维持体系的pH。 无菌：组织培养成功的关键因素之一就是要避免污染，要树立无菌操作观念，从实验用品、培养基和试剂、操作环境的灭菌消毒到超净台下的实验操作，每一步都应该严谨规范。 以单层细胞方式生长的细胞分泌细胞外基质和黏蛋白以附着于生长表面。不但不同的细胞系附着于表面的黏附程度有差异，不同状态的细胞这种黏附也有差异。比如衰老的二倍体细胞通常比年轻的二倍体细胞黏附得更牢固。绝大多数的贴壁细胞需要用胰蛋白酶优先催化碱性氨基酸与邻近氨基酸羧基间的肽键水解，从而分解粘蛋白、糖蛋白，使细胞脱壁；有些细胞系贴壁不强，只要用吸管吹打即可使细胞脱落分散，而不需要使用胰蛋白酶；还有些细胞贴壁能力很强需要使用其他的蛋白酶，比如弹性蛋白酶、链霉素的酶等。为保障胰蛋白酶的最佳活性，在进行胰蛋白酶处理前应去除血清、Ca2+及Mg2+离子。 实验材料与试剂 材料：肝癌7404细胞和 hela细胞。 设备与用品：倒置显微镜，普通光学显微镜，CO2培养箱，超净工作台，高压灭菌锅，0.22μm的一次性滤器，无菌一次性注射器，细胞培养瓶，移液管，1ml吸头，200ul吸头，15ml离心管，50ml离心管，无菌1.5ml离心管，酒精灯，脱脂棉，试管架等，24孔板，研钵，细胞计数板，1 ml移液器,200ul移液器。 药品与试剂：RPMI-1640培养基；胎牛血清；DMEM培养基，含EDTA的0.25%胰蛋白酶，PBS,75%酒精，无菌去离子水，太子参，白茶，新洁尔灭 实验方法与步骤－细胞复苏 冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。 细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常。 材料  37oC恒温水槽 、新鲜培养基、无菌吸管/ 离心管/ 培养瓶 步骤： 将新鲜培养基置于370C水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。 取出冷冻管，立即放入37oC 水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化，以75%ethanol擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。 将细胞悬浮液加入有培养液的离心管中，1,500rpm离心5，弃上清，加入1ｍl培养液重悬细