实验五六要点.pptVIP

实验五、淋巴细胞分离实验实验六、E玫瑰花环形成实验 程 燕 实验五、淋巴细胞分离实验 实验目的 熟悉淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC）的分离原理和方法 Ficoll-Hypaque密度梯度离心法 实验原理 各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。 特异性细胞免疫功能测定时，需要从人外周血中分离纯化外周血单个核细胞 （peripheral blood mononuclear cells ，PBMC） 外周血 红细胞 粒细胞 单个核细胞 血小板 淋巴细胞 单核细胞 1.093 1.030~1.035 1.075 (PBMC) 1.092 最常用的Ficoll-Hypaque密度梯度离心法 是由聚蔗糖（Ficoll）和泛影葡胺（Hypaque）按一定比例混合制成。它分子量大又无化学活性，20oC 时比重为1.077±0.001 kg/L 用此方法分离PBMC纯度可达95％，淋巴细胞约占90％，其中T淋巴细胞占80％，B淋巴细胞占4～10％ 最常用的Ficoll-Hypaque密度梯度离心法 血液中各细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，通过离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 淋巴细胞和单核细胞位于分离液的上层，而粒细胞和红细胞沉于离心管的管底，从而将淋巴细胞和单核细胞等单个核细胞分离出来。 2000rpm, 20℃ , 20min PBMC 红细胞粒细胞 Ficoll 稀释外周血 Ficoll 稀释的血浆、血小板 实验器材 注射器：2ml（豚鼠），5ml（兔子） 1ml刻度吸管、尖吸管、普通吸管 一次性离心管：15ml（离心用） 5ml（装样品） 肝素钠注射液、 无Ca、Mg的Hanks液、 淋巴细胞分离液 家兔、豚鼠 离心机、天平 实验步骤 一、采血前的准备 用刻度吸管取2ml淋巴细胞分离液于15ml离心管中. 用注射器吸取0.2ml的肝素钠注射液，湿润管壁，并保存在注射器中． （1:500u浓度的肝素钠使用剂量为每毫升血液10-50u） 二、心脏采血 选心脏搏动最强部位（胸骨左缘三、四肋间）穿刺。 针头宜稍细长些，以免发生术后穿刺孔出血. 豚鼠由助手握住前后肢进行心脏采血。 采血量为2ml，加入到5ml离心管中。 实验步骤 三、抗凝血的处理 抗凝血2mL，加2ml的Hanks液，稍微吹打混匀，使之混合稀释。 将上述4ml稀释血液加入到2mL淋巴细胞分离液的液面之上 注意：沿管壁轻轻加入，勿使两液相混 实验步骤 四、离心 2000转/分钟，离心20-30分钟，而后轻轻从离心机中取出。 注意： 离心之前一定要配平 实验步骤 五、提取淋巴细胞 用尖吸管吸取（吸前要用Ｈanks润洗尖吸管２次）界面处的淋巴细胞与单个核细胞，置于15ml离心管中。 洗涤 ：于管中加5倍体积的Hanks液，然后离心（1500转/分离心5分钟）弃上清即可。 实验步骤 注意事项 1.在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面 2. 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染 实验六、E玫瑰花环形成实验 实验目的 熟悉免疫细胞的检查及功能 1、学习E花环试验的操作方法 2、观察显微镜下E花环的形态 实验原理 人 T淋巴细胞表面的CD2分子即绵羊红细胞受体（ER），在一定的实验条件下，可与绵羊红细胞（SRBC）结合，形成玫瑰花结，称为E玫瑰花环试验。 该试验常用于临床检测人外周血T淋巴细胞的数量和比例，由此可间接反映机体的细胞免疫功能状况。 实验原理 应用最广的有总E花环试验(Et，t为total的缩写)和活性E花环试验(Ea，a为active 的缩写)。Et代表被检标本中T淋巴细胞的总数，Ea则反映具有高亲和力绵羊红细胞受体的T细胞数，这部分T细胞的免疫学功能更能反映机体细胞免疫功能和动态变化。正常值为25%-40% 实验器材 注射器、刻度吸管、毛细吸管、玻片、试管、离心管 肝素、无Ca、Mg的Hanks液、淋巴细胞分离液、双蒸水、生理盐水、 0.8%戊二醛、瑞氏染液 家兔红细胞悬液 、豚鼠淋巴细胞、灭活小牛血清 离心机、水浴箱、显微镜等。 实验步骤 豚鼠外周血 家兔红细胞 淋巴细胞 分离 5ml离心管 + 压积细胞0.2ml 1%红细胞0.1ml 加等量灭活小牛血清0.1ml 混匀，37℃温箱放置5分钟 家兔外周血 分离 1000rpm离心5min 加1小滴美兰染色剂，轻轻混匀 取1滴于玻片上，加上盖玻片 高倍镜下观察玫瑰