实验一细胞培养技术要点.pptVIP

1.培养细胞的生长方式 ①贴附生长： 必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 ②悬浮生长： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。 3.细胞的生长条件 恒定的温度：37℃，5%CO2培养箱 恒定的湿度:培养箱中有水盘 等渗环境：培养液提供 营养物质：培养液提供 无污染：包括微生物的污染和杂质的污染 要求使用纯水，并对所有和细胞接触的物品都要清洗干净并灭菌，培养液中还要加入青链霉素，操作在无菌环境下进行 培养用器皿：培养皿，培养瓶等 气体：培养器皿并非完全密闭的，细菌不能通过，气体可以 尽量恒定的pH值：NaHCO3与CO2形成缓冲对。5% CO2 。 各种操作液：如胰酶，EDTA，PBS等。 此外还要对细胞状态进行观察和监测（倒置显微镜）。 五、实验准备工作 1.实验器具及设备： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：细胞培养瓶，细胞培养板，细胞冻存管 超净工作台 CO2培养箱 细胞培养瓶 2.常用器皿清洗 玻璃器皿用自来水浸泡、洗涤剂刷洗、烘干、浸酸（24小时）。 流动的自来水洗10遍，蒸溜水冲洗3次，三蒸水或纯净水洗1次，180℃干热灭菌4h-6h。 塑料及橡胶制品等，超声波清洗3次，121℃高压湿热灭菌15min,烘干备用。 3.细胞培养用液的配制 ①水：新鲜的三蒸水或去离子水 ②平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml ③消化液 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液可以终止其对细胞的消化作用。 ④培养基 A. 天然培养基 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。 成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 易发生支原体污染。 B. 合成培养基 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM、DF12等。 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低。 缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 青霉素抑制细菌的细胞壁合成。 链霉素抑制细菌蛋白质的合成。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 六、细胞的培养方法 主要包括两种 1.原代培养：将机体取出的组织或细胞进行初次培养的过程。 2.传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养。 贴壁生长细胞传代方法 1.弃掉培养瓶中的培养液。 2.加入1-2 ml 0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置2-10min（显微镜下动态监测）。 3.吸去胰蛋白酶液，加入培养液。 4.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液。 5.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的新培养瓶内。 6.将后者放入培养箱中培养。 无菌室 着装 消化数分钟 中止消化、吹散细胞 七、实验结果与讨论 描述HepG2细胞在传代培养不同阶段的形态。 细胞的传代培养过程中需要注意哪些问题？ 抗菌素的使用 下风口 上风口 细胞传代 37℃、5％CO2培养 贴壁培养的肿瘤细胞 * * 实验一 细胞培养技术 一、定义 细胞培养（cell culture）是指将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境下使其继续生长增殖的过程。 一般体外培养的细胞不会发生分化成为组织，在体外培养的条件下可以观察细胞生命活动规律，此外收获细胞本身的同时也可以收获细胞的产物。 1、美国生