原生质体融合技术概述.pptVIP

原生质体融合技术 学号：11110010127 姓名：魏福静 原生质体融合技术 1、原生质体融合技术的发展 2、原生质体的制备 3、原生质体形成率的计算 4、灭活原生质体融合 5、原生质体融合的方法 6、原生质体融合技术应用与展望 1、原生质体融合技术发展简介 原生质体融合技术育种( protoplast fusion)是20世纪70年代发展起来的基因重组技术。通过两个遗传性状不同的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。从1960年法国的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了自发融合现象到1979年匈牙利的Pesti提出了运用融合育种技术提高青霉素的产量,原生质体融合技术的成熟使得开始了在微生物育种实际工作中的应用。  原生质体融合技术的优点 1）可实现常规杂交方法无法做到的种间、属间、门间甚至跨界的远缘杂交； 2）并可以大幅度提高亲本之间的重组频率，集中双亲株优良性状的机会更大。 3）与常规杂交技术相比，原生质体融合时亲本整套染色体参与交换,遗传物质转移和重组性状较多,集中双亲本优良性状机会更大，为异源DNA片段交叉互换创造一个优良的环境； 4）大幅度提高亲本之间重组频率，扩大了重组的亲本范围。 2、原生质体的制备 2.1 原生质体融合技术的过程 原生质体融合技术一般包括标记菌株的筛选、原生质体制备、培养、融 合、再生, 原生质体转化等。 原生质体的制备首先要去除细胞壁,当前去壁的方法主要有机械法、非酶法和酶法, 现在使用较多的为酶法。 2. 2 原生质体制备条件的确定 具体包括： 1）酶解温度； 2）酶浓度； 3）酶解时间； 4）甘氨酸； 5）渗透压； 6）菌龄； 酶解温度对原生质体制备的影响 不同的酶具有各自不同的最适温度，同时还要注意菌株生长的最适温度，以避免因温度不当而导致原生质体活性降低，甚至破坏，因此确定酶解温度通常要二者兼顾，这对水解细胞壁是至关重要的。一般酶解温度控制在20~40度。 酶浓度对原生质体制备的影响 原生质体形成率在一定范围内与溶菌酶的浓度成正比。当浓度过高溶菌酶作用于原生质体时，形成率得到提高高，但溶菌酶中往往含有一些对原生质体有害的酶类（如过氧化物酶、核糖核酸酶等），因此，当达到一定浓度时，必然会严重地影响原生质体的活性； 而且酶量过大会使细菌脱壁太彻底，失去了原生质体再生时合成细胞壁的引物，易使菌体凝集，降低原生质体的再生率。 酶解时间对原生质体制备的影响 充足的酶解时间是细菌原生质体化的必要条件，原生质体形成率随酶解时间延长而增加，但再生率会由于随酶解时间过长导致细胞壁脱壁彻底无法再生而降低。 原因可能是酶解超过某一临界值后，细胞壁消化过于充分使细胞破裂或失去再生能力，从而导致再生率的降低再生培养基的组分也是影响原生质体再生的一个重要因素。 因此要控制好原生质体制备时的酶解时间。 甘氨酸浓度对原生质体制备的影响 在培养基中添加一定浓度的甘氨酸培养后，易于使细胞壁的网状结构松动，释放原生质体，可有效促进菌丝体细胞壁形成对溶菌酶敏感的结构，提高制备的原生质体质量; 添加甘氨酸后，发酵液的状态也有所改变，菌丝结块、挂壁现象减少，菌丝分散更加均匀。 但过高的甘氨酸浓度会抑制菌体的正常生长而得不到足够的菌丝体。 渗透压对原生质体制备的影响 原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持其生存； 在低渗溶液中，原生质体将会破裂而死亡，对于不同的菌种，采用的渗透压稳定剂不同。 2.3原生质体形成率的计算 计算方法：常用的是血球计数板记数法。 原生质体形成率(% )=(酶解前的菌落数-酶解后的菌落数）/酶解前的菌落数×100%。 3、灭活原生质体融合 3.1亲本及其遗传物质的标记选择 常用的有带隐性性状的营养缺陷性和抗性标记，还有热致死（灭活），孢子颜色和菌落形态。目前比较好的是灭活标记。 3.2常用的灭活标记方法： 1）热灭活：主要作用在细胞质中，使核糖体16S亚基或核糖体RNA受到损伤。 2）紫外线灭活：致死损伤部位主要在DNA位点上。 3）化学药剂灭活：使细胞代谢过程中的某些关键酶不可逆的失活，导致原生质体即使在适宜的条件下仍然不能再生。 3.3灭活的机理 3.4灭活原生质体特点与应用 灭活机制 目前对灭活原生质体的融合机制还不很清楚。 1）Wright 的损伤互补原则 Wright使用不同的生化药剂分别灭活两株动物细胞，融合后得到了活的杂交细胞，他认为这是由于两株细胞的致死损伤得到了互补的结果。Fodor等热灭活带有标记的 B.megaterium 的二个亲株原生质体，经PEG 诱导后未获