副猪嗜血杆菌OMP5基因的克隆、表达及间接ELISA检测方法的建立.pdfVIP

中国农业科学 2011,44(14):3036-3044 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.14.021 副猪嗜血杆菌OMP5 基因的克隆、表达及 间接ELISA 检测方法的建立 1，2，3 1 2 2 陈善真 ，李春玲 ，贾爱卿 ，王贵平 1 2 3 （广东省农业科学院兽医研究所，广州 510640； 广东现代农业集团研究院，广州 510630 ； 华南农业大学兽医学院，广州 510642 ） 摘要：【目的】利用表达纯化的副猪嗜血杆菌（ Haemophilus Parasuis，HPS）外膜蛋白P5 （outer-membrane protein P5，OMP5），建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接 ELISA 检测方法。【方法】克隆扩增 HPS OMP5 基因，并 将 OMP5 基因与原核表达载体 pET-32a(+)连接，通过 PCR、双酶切及测序鉴定后，将阳性重组质粒转化入受体菌 BL21 （DE3），经IPTG 诱导表达。亲和层析法纯化蛋白，尿素梯度透析复性，Western blot 鉴定表达产物。将超 声破碎抗原和复性蛋白分别按不同浓度包被酶标板，通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度，并对 其它条件进行优化，最终建立检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA 方法。【结果】利用克隆表达的HPS OMP5 蛋白 做抗原，通过方阵滴定法确定蛋白最佳包被浓度为 1:400，血清的最佳稀释度为 1:160。用建立的间接ELISA 方 法检测317 份未进行HPS 免疫的健康猪血清，结果检出72 份阳性，检出率为22.71%，与广东地区发病猪中的HPS 分离率24%接近。同时，用该方法与用超声破碎抗原建立的ELISA 方法同时检测了78 份血清样品，结果，该法检 出27 份阳性，检出率为34.62%，后者则检出31 份阳性，检出率为39.74%，二者符合率为71.79%。【结论】本研 究利用重组表达的OMP5 蛋白作为抗原建立的检测副猪嗜血杆菌抗体的间接 ELISA 方法，特异性好、重复性好， 检出率与HPS 临床分离率接近，可用于副猪嗜血杆菌的临床检测、流行病学调查和免疫监控。 关键词：副猪嗜血杆菌；外膜蛋白P5；克隆；表达；间接ELISA Expression of Outer Membrane Protein P5 Gene of Haemophilus Parasuis and Establishment of an Indirect ELISA Based on the OMP5 Protein 1,2,3 1 2 2 CHEN Shan-zhen , LI Chun-ling , JIA Ai-qing , WANG Gui-ping 1 2 ( Institute of Veterinary Medicine, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640; Guang