过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立及其成肌诱导分化.pdfVIP

中国农业科学 2013,46(14):3032-3039 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.14.019 过表达MyoD1 基因山羊胎儿成纤维细胞系的建立 及其成肌诱导分化 李 伟, 郑蒙蒙, 张亚妮, 朱才业, 邱峰龙, 韦光辉, 李碧春 （扬州大学动物科学与技术学院，江苏扬州 225009 ） 摘要：【目的】通过建立过表达MyoD1 基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1 基因的异位表达研究其在成肌 分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR 从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1 基因，并将其 cDNA 终止密码子 TGA 定向突变为GGA，定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白（ehanced green fluorescent protein，eGFP） 报告基因的真核表达载体 pEGFP-N1 中，构建融合蛋白表达载体 pEGFP-MyoD1，经过酶切、测序鉴定后，采用 LipofectiminTM LTX 转染山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast，GEF）以建立MyoD1 异位表达细胞 株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化，探究MyoD1 在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊 MyoD1 基因，并在MyoD1 的开放阅读框（ORF）两端引入Xho Ⅰ/EcoR Ⅰ酶切位点，将其终止密码子TGA 定点突变 -1 为GGA，定向克隆至pEGFP-N1 真核表达载体，获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1；经G418 （400 μg·mL ）筛选 2 周后，获得MyoD1 异位表达的GEF 细胞株；间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay，IFA）检测 结果显示该细胞株能够表达Myf-5 等成肌相关免疫学标志；采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d 可见少量肌 管产生，并表达MyoG、Desmin 和MyHC 等早期成肌分化标志，处理5 d 可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山 羊MyoD1 基因，构建了pEGFP-MyoD1 真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF 细胞系，过表达MyoD1 GEF 系能够在 成肌诱导培养液诱导形成肌管。 关键词：MyoD1 基因; 基因克隆; 异位表达; 成肌分化 Construction of MyoD1 Expressed Goat Embryonic Fibroblast Line and the Myogenesis of This Cell LI Wei, ZHENG Meng-meng, ZHANG Ya-ni, ZHU Cai-ye, QIU Feng-long, WEI Gaung-hui, LI Bi-chun (The College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, Jiangsu) Abstract: 【Objective 】MyoD1 ectopic expression goat fibroblast line was constructed to explore the bio-functions of MyoD1 in myogenesis. 【Method 】MyoD1 was cloned from the skeletal satellite cell via RT-PCR method. To visualize the MyoD1 protein, MyoD1 was reconstructed to pE