奶山羊SCD基因CDS区的克隆、序列分析及过表达.pdfVIP

中国农业科学 2012,45(24):5091-5101 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.24.015 奶山羊SCD 基因CDS 区的克隆、序列分析及过表达 石恒波, 罗 军, 朱 越, 王紫骞, 赵旺生 （西北农林科技大学动物科技学院/ 陕西省农业分子生物学重点实验室，陕西杨凌 712100 ） 摘要：【目的】研究奶山羊硬脂酰辅酶A 去饱和酶基因（stearoyl-CoA desaturase，SCD）在乳腺上皮细胞 中对不饱和脂肪酸合成过程相关基因的调控及对细胞脂肪酸组成的影响。【方法】用RT-PCR 方法从西农萨能羊乳 腺组织中扩增SCD 基因，进行序列分析和组织表达谱分析；构建重组腺病毒质粒，进行包装和扩增后，感染体外 培养的奶山羊原代乳腺上皮细胞，实时定量检测相关基因的表达，western blotting 检测蛋白变化，气相色谱- 质谱联用分析细胞内脂肪酸组成变化。【结果】①获得了全长1 080 bp 的山羊乳腺SCD 基因CDS （GenBank 登录号： GU947654）并对其进行了生物信息学分析；②奶山羊SCD 基因在乳腺、肺和皮下脂肪组织中高表达，而在心脏、 瘤胃和卵巢组织中的表达量较低；③成功构建了奶山羊SCD 基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度的重组病毒液， 重组腺病毒感染原代乳腺上皮细胞后，检测结果表明细胞中SCD 基因过表达极显著，FASN、H-FABP、LEPR 和LXR α等基因表达下调，而PPAR γ和LPL 基因的表达量显著性增加；④棕榈酸和硬脂酸的含量下降，不饱和脂肪酸含 量上升。【结论】SCD 基因在奶山羊乳腺中发挥着重要作用，FASN、H-FABP、LEPR、LXR α、PPAR γ和LPL 基因的 表达与其相关，这些基因共同影响乳脂中脂肪酸的组成。 关键词：奶山羊; 硬脂酰辅酶A 去饱和酶; 乳腺上皮细胞; 腺病毒; 过表达 Cloning, Sequence Analysis and Over-Expression of SCD Gene of Dairy Goat SHI Heng-bo, LUO Jun, ZHU Yue, WANG Zi-qian, ZHAO Wang-sheng (College of Animal Science and Technology, Northwest AF University/Shaanxi Provincial Key Laboratory of Molecular Biology for Agriculture, Yangling 712100, Shaanxi) Abstract : 【Objective 】To study the function of stearoyl-CoA desaturase (SCD) gene in mammary gland fatty acid metabolism emphasizing on how it regulates genes involved in unsaturated fatty acid synthesis as well as its impact on fatty acid composition. 【Method 】The sequence of SCD in dairy goat was cloned using RT-PCR for bioinformatics and tissue mRNA expression analysis. A recombinant adenovirus vector was constructed to over-express the gene in cultured goat mammary epithelial cells. Changes of gene expression, protein yi