牛布鲁氏菌毒力基因Virb8间接ELISA检测方法的建立与应用.pdfVIP

中国农业科学 2013,46(16):3460-3469 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2013.16.017 牛布鲁氏菌毒力基因Virb8 间接ELISA检测方法的建立与应用 1,2 2 1 1 3 1 张 剑 ，马卫明 , 张 亮 ，何洪彬 ，丁家波 ，杨宏军 1 2 3 （山东省农业科学院奶牛研究中心，济南 250100 ； 山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018 ； 中国兽医药品监察所，北京 100081） 摘要：【目的】布鲁氏菌virb8 蛋白是布鲁氏菌的重要毒力因子，本研究拟构建含布鲁氏菌Virb8 基因的原 核表达载体，利用纯化蛋白作为包被抗原，建立检测牛布鲁氏菌血清抗体的间接ELISA 方法（iELISA）。【方法】 根据GenBank 中的牛型布鲁氏杆菌Virb8 序列，设计一对引物，以布鲁氏菌疫苗株S2 全基因组DNA 为模板扩增 Virb8 的基因，将目的基因克隆入 PEASY-T3 ，经测序正确后，与载体 pET-32a(+)连接，构建重组表达质粒 pET-32a-Virb8，转化E.coli BL21(DE3)，诱导表达融合蛋白pET-32a-Virb8，经SDS及Western-blot 分析 鉴定后，采用Ni-NTA Spin Kit 纯化目的蛋白，利用所建立的iELISA 方法对235 个临床奶牛血清样本进行检测， 并与虎红平板凝集实验进行比较。【结果】成功构建了含Virb8 的表达载体，经多次对表达条件的优化，大量表达 了目的蛋白，建立的iELISA 方法具有稳定、灵敏的特点，与虎红平板凝集试验的符合率可达97.02%。【结论】所 建立的iELISA 方法是一种有效的牛布鲁氏菌病血清学诊断的方法，为进一步研究其免疫原性和抗感染保护作用奠 定了基础。 关键词：布鲁氏菌；Virb8；间接ELISA Development of iELISA for Detection and Application of Brucella abortus Virb8 1,2 2 1 1 3 1 ZHANG Jian , MA Wei-ming , ZHANG Liang , HE Hong-bin , DING Jia-bo , YANG Hong-jun 1 , 2 ( Cow Research Center, Shandong Academy of Agricultural Science, Ji nan 250100; College of Veterinary Medicine, Shangdong Agricultural University, Tai ’an 271018, Shandong; 3 China Institute of Veterinary Drug Control, Beijing 100081) Abstract : 【Objective 】 Brucella abortus Virb8 is an important Brucella virulence factor. The aim of this study wa