家蚕免疫负调控分子BmFAF的功能.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(15):3085-3093 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.15.018 家蚕免疫负调控分子BmFAF 的功能 马晓娟，李亚明，胡翠美，王 菲，夏庆友 （西南大学家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆400716 ） 摘要：【目的】在细胞和个体水平上探讨家蚕BmFAF 的免疫负调控功能，为研究昆虫免疫稳态提供参考。【方 法】通过RT-PCR 技术克隆BmFAF 并进行结构域预测和分析；利用荧光定量PCR 检测BmFAF 在家蚕各龄期以及5 龄 第3 天幼虫的各组织中的时空表达特征和家蚕感染细菌后的免疫诱导表达特征；构建BmFAF 的细胞表达载体以及 合成用于RNAi 的dsRNA，通过质粒或dsRNA 的转染在BmE 细胞中过表达BmFAF 或降低BmFAF 的表达水平，并利用 Western blotting 或定量PCR 予以确认，同时检测抗菌肽基因表达水平的变化；通过注射dsRNA在个体中降低BmFAF 的表达水平，并检测BmFAF 对抗菌肽基因表达水平和家蚕感染细菌后存活率的影响。【结果】BmFAF 与其他物种FAF 家族成员有较高的同源性，与人类HsUBXD8、HsFAF1 和果蝇DmCaspar 分别具有60%、42%和47%的相似性，并具有 保守的 UBX 结构域。时空表达特征分析表明，除生殖腺外，BmFAF 在免疫组织中表达量略高于其他组织，眠蚕期 表达量显著高于起蚕期，尤其在 2 龄和 3 龄眠蚕中的表达量最高；5 龄时BmFAF 的表达量普遍较低，而从5 龄发 育至预蛹期时，BmFAF 的表达水平有所上升。免疫诱导表达谱显示，家蚕在注射感染黑胸败血芽孢杆菌或黏质沙 雷氏菌0.5 h 后，脂肪体中BmFAF 的表达水平即显著下降，且在12 h 内没有恢复，而抗菌肽BmCecropinA1 的表 达则持续上升，并在12 h 时达到最高。在BmE 细胞中过表达BmFAF，抗菌肽BmCecropinA1、BmAttacin 和BmMoricin 的表达水平与转染对照质粒的细胞中的抗菌肽相比，均显著降低。在细胞中转染 dsRNA 后，BmFAF 的表达水平被 有效地降低50%—60%，抗菌肽BmCecropinA1 和BmMoricin 的表达水平与对照相比均显著升高。对5 龄第2 天家 蚕幼虫注射dsRNA，24 h 后通过荧光定量PCR 检测到BmFAF 的表达水平在注射dsFAF 的家蚕中下降至注射dsEGFP 对照中的 45%；而抗菌肽 BmCecropinA1 和BmMoricin、BmAttacin 的表达水平均被显著上调。这些家蚕通过注射 感染黏质沙雷氏菌 24 h 后，死亡率即低于对照组，在感染 72 h 后仍有 40%左右的家蚕存活，而对照组中则无家 蚕存活。【结论】结构分析、表达特征以及细胞和个体水平上的功能研究表明，BmFAF 是一个具有免疫负调控作用 的分子，通过抑制抗菌肽的表达维持家蚕免疫稳态, 而降低BmFAF 的表达水平则导致抗菌肽表达水平升高，从而 有助于减缓甚至避免家蚕在感染细菌后的死亡。 关键词：家蚕；免疫负调控；BmFAF ；表达特征；抗菌肽；存活率 Functional Characterization of BmFAF as an Immune Negative Regulatory Molecule in Silkworm (Bombyx mori) MA Xiao-juan, LI Ya -ming, HU Cui-mei, WANG Fei, XIA Qing-you (State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716) Abstract: 【Objective 】The objective of this study is to characterize BmF