橘小实蝇羧酸酯酶基因BdCAREB1的克隆及其表达模式解析.pdfVIP

中国农业科学 2014,47( 10): 1947-1955 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.10.008 橘小实蝇羧酸酯酶基因BdCAREB1 的克隆及其表达模式解析 申光茂，豆 威，王进军 （西南大学植物保护学院昆虫学及害虫控制工程重庆市市级重点实验室，重庆 400716 ） 摘要：【目的】在克隆获得橘小实蝇（Bactrocera dorsalis ）1 条羧酸酯酶基因全长序列的基础上，解析该 基因在橘小实蝇不同发育阶段和组织以及经高效氯氰菊酯饲喂后的表达模式。同时结合之前完成的有关橘小实蝇 羧酸酯酶生化特性以及增效剂处理研究结果，综合分析橘小实蝇羧酸酯酶对高效氯氰菊酯作用的应激反应，为明 确羧酸酯酶对菊酯类杀虫剂的解毒代谢机制奠定基础。【方法】通过同源序列比对的方法，从橘小实蝇转录组数据 中筛选出1 条羧酸酯酶基因序列片段，利用cDNA 末端快速扩增技术（RACE ）扩增得到该基因的全长cDNA 序列； 应用生物信息学分析软件对该基因的开放阅读框、编码的氨基酸序列、分子量等信息进行预测，并基于最大似然 法构建该基因与其他昆虫相关基因序列的系统发育树，阐明其分子生物学特征。此外，分别提取橘小实蝇不同发 育阶段以及 3 龄幼虫的中肠、脂肪体、马氏管和气管等组织的 RNA，在内参基因稳定性评估筛选的基础上，运用 qPCR 的方法解析该基因在不同发育阶段和组织间以及药剂处理后的表达模式。【结果】从橘小实蝇转录组数据库 中筛选出1 条长度为1 028 bp 的羧酸酯酶基因片段，通过对5′端和 3′端进行RACE 扩增分别得到长度为1 073 和 625 bp 的目的片段，经序列拼接和验证后，确定该基因全长为 1 872 bp，完整开放阅读框 1 710 bp，编码 569 个氨基酸，推测其蛋白质分子量为 63.3 kD，理论等电点6.38。该基因经序列比对命名为BdCAREB1，GenBank 登 录号为KF539980。基于最大似然法构建的系统发育树显示，该基因编码的蛋白质与双翅目昆虫的羧酸酯酶具有高 度的同源性。分析其在不同发育阶段的表达模式发现，BdCAREB1 在3 龄幼虫期的表达量最高，其次为成虫期，而 在卵期的表达量最低。在橘小实蝇3 龄幼虫不同组织间的定量分析结果表明，BdCAREB1 在脂肪体中表达水平最高， -1 其次在中肠和马氏管的表达水平较低且接近，而在气管的表达量最低。经饲喂 0.33 μg∙g （药剂/饲料）的高效氯 氰菊酯后检测BdCAREB1 在整虫及组织间的表达情况发现，该基因在幼虫以及脂肪体中的表达量显著上调。【结论】 橘小实蝇BdCAREB1 的表达具有发育阶段和组织特异性，在幼虫期和脂肪体的表达量最高，并对高效氯氰菊酯处理 表现出明显的应激反应，具有可诱导性。结合此前完成的橘小实蝇羧酸酯酶活性测定及增效剂研究结果，分析该 基因很可能参与橘小实蝇对高效氯氰菊酯的解毒代谢。 关键词：橘小实蝇；羧酸酯酶；基因表达；脂肪体；解毒代谢 Cloning and Expression Analysis of a Carboxylesterase Gene BdCAREB1 from Bactrocera dorsalis SHEN Guang-mao, DOU Wei, WANG Jin-jun (Key Laboratory of Entomology and Pest Control Engineering, College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 40071 6) Abstract ：【Objective 】Based on the cloning of a carboxylesterase gene of Bactrocera do