结球甘蓝SRK-ARC1-Exo70A1互作域的确定及作用强度.pdfVIP

中国农业科学 2016,49(1):14-26 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.01.002 结球甘蓝SRK-ARC1-Exo70A1互作域的确定及作用强度 1,2 1,2 2 1 2 2 1 施松梅 ，高启国 ，廉小平 ，毕云龙 ，刘晓欢 ，蒲全明 ，刘贵喜 ， 1 2 1 1 2 柳 菁 ，任雪松 ，杨晓红 ，朱利泉 ，王小佳 1 2 （西南大学农学部，重庆 400715 ； 重庆市蔬菜学重点实验室，重庆 400715 ） 摘要：【目的】深入研究甘蓝自交不亲和信号传导关键元件S-位点受体激酶 SRK 与臂重复蛋白 ARC1 及 ARC1 与 Exo70A1 间相互识别的分子机理，鉴定 SRK-ARC1 及 ARC1-Exo70A1 之间的互作区段，并分析其作用强度，明确 蛋白间互作功能域。【方法】通过生物信息学分析得到蛋白功能域，根据分析结果以典型的自交不亲和结球甘蓝 E1为材料分别扩增 SRK、ARC1 和 Exo70A1 含不同功能域的截短体片段，利用分子克隆技术将SRK激酶域（SRKj） 及其截短体SRKjΔ1—SRKjΔ4，Exo70A1全长及其截短体Exo70A1Δ1—Exo70A1Δ3的编码序列分别亚克隆至pGADT7 （AD）质粒，将ARC1及其截短体ARC1Δ1—ARC1Δ8的编码序列分别亚克隆至载体pGBKT7（BD）质粒。用PEG/LiAc 法将获得的AD和BD重组质粒两两组合分别共转化到酵母AH109感受态中，观察融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/ X-α-gal/25 mM 3-AT 平板上的菌落生长情况和颜色变化情况，进一步测定其 β-半乳糖苷酶活性。最后通过原核 表达体外孵育检测蛋白质相互作用的方法对SRK-ARC1及 ARC1-Exo70A1的相互作用进行验证。【结果】DNA测序和 内切酶分析显示成功构建 18 个酵母双杂交表达载体，且无自激活能力。在 SRK-ARC1 的 10 个试验组合中，只有 ARC1Δ4、ARC1Δ8、ARC1 与 SRKj 组合的融合菌株在 SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 mM 3-AT 培养基上长出蓝 色菌落，激活报告基因 HIS3、ADE2 和 MEL1。随着 SRKj 或 ARC1 截短体片段的延长，二者的 β-半乳糖苷酶活性逐 渐增加，其中，ARC1Δ4与SRKj组合的 β-半乳糖苷酶活性最高（酶活为15.98）。在ARC1-Exo70A1 16个试验组合 中，Exo70A1Δ3与ARC1Δ1Δ3 都相互作用，其融合菌株在SD/-Leu-Trp-His-Ade/X-α-gal/25 mM 3-AT培养基上长 出蓝色菌落，激活报告基因HIS3、ADE2 和 MEL1。随着 ARC1 或 Exo70A1 截短体片段的延长，二者的β-半乳糖苷 酶活性呈现先增加后降低的趋势，其中ARC1Δ2与Exo70A1Δ3组合的 β-半乳糖苷酶活性最大（酶活性为25.07）。 说明ARC1的 N 端和 Exo70A1的N端发生了互作，而ARC1 的C端、全长与Exo70A1都不发生互作。体外表达检测 蛋白相互作用发现，SRKj与ARC1Δ4、ARC1Δ2 与Exo70A1Δ3 均可以直接发生相互作用。【结论】SRK的激酶域（SRKj） 与 ARC1 的 C 端臂重复区发生互作，缩短 SRK 激酶域中的任何结构域或者缩短 ARC1 的臂重复区，二者都不会发生 互作。ARC1的亮氨酸拉链和蜷曲螺旋与Exo70