噬菌体展示纳米抗体模拟黄曲霉毒素抗原的活性表征.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(4):685-692 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.04.008 噬菌体展示纳米抗体模拟黄曲霉毒素抗原的活性表征 1,2,4 1,2,3,4,5 1,3,4 1,4,5 1,2,5 王妍入 ，李培武 ，张 奇 ，丁小霞 ，张 文 1 2 3 （中国农业科学院油料作物研究所，武汉 430062 ； 农业部油料作物生物学与遗传育种重点实验室，武汉430062 ； 农业部生物毒素检测重点实验 4 5 室，武汉 430062 ； 农业部油料产品质量安全风险评估实验室（武汉），武汉430062 ； 农业部油料及制品质量监督检验测试中心，武汉430062 ） 摘要：【目的】笔者实验室前期免疫并构建噬菌体展示纳米抗体库，应用此抗体库筛选、制备可以用作黄曲 霉毒素无毒替代抗原的纳米抗体。本研究旨在探明已筛选出的噬菌体展示纳米抗体Phage 2-5 用作黄曲霉毒素替 代抗原的活性，为后续纳米抗体的合成以及黄曲霉毒素绿色免疫分析方法的建立奠定基础。【方法】前期，笔者实 验室对羊驼免疫黄曲霉毒素抗原（AFB -BSA ），经过5 次免疫后，取血，提取RNA，反转录为cDNA，并采用PCR 技 1 术对抗体可变区VHH 区域进行扩增，与载体pComb3X 偶联，构建噬菌体展示纳米抗体库；经过吸附-洗脱的淘选过 程筛选出能够与黄曲霉毒素竞争结合抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11 的噬菌体展示纳米抗体Phage 2-5。本研究通 过将抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11 固定在酶标板上，以噬菌体展示纳米抗体Phage2-5 作为竞争抗原，与反应体 系中的游离黄曲霉毒素竞争结合抗体，构建酶联免疫分析（ELISA ）体系，检测游离黄曲霉毒素含量，并分别对该 方法的灵敏度、交叉反应率、缓冲液和样品基质对反应体系的影响进行测定。【结果】采用棋盘法确定了抗体最佳 -1 11 包被浓度为 1.25 g·mL ，噬菌体最佳使用浓度为 510 pfu/mL。在最优条件下建立基于噬菌体展示纳米抗体 -1 Phage2-5 的ELISA 法，对黄曲霉毒素B 的IC 值为0.054 ng·mL ，对黄曲霉毒素B 、G 、G 、M 的交叉反应率分别 1 50 2 1 2 1 为38.6%、70.1%、14.5%、14.6%；反应最高耐受甲醇浓度为20%；当pH 值为7.0 时，反应灵敏度最高，升高或降 低 pH 对反应灵敏度均有影响；盐离子浓度对反应灵敏度影响不大，反应体系在 5PBS 的环境下仍能保持较高活 -1 性，但纯水溶液不利于反应的进行；因此，该反应的最佳反应缓冲液是pH 值为7.0 的0.01 mol·L 磷酸盐缓