水牛Oct4、Nanog基因的克隆及其在水牛胎儿成纤维细胞中的表达.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(2):394-402 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.02.019 水牛Oct4、Nanog 基因的克隆及其在水牛胎儿 成纤维细胞中的表达 邓彦飞, 刘庆友, 邓海莹, 罗 婵, 杨素芳, 石德顺 （广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁530005 ） 摘要：【目的】转录因子Oct4、Nanog 是调节干细胞多能性相关的转录因子，在干细胞的分化和胚胎发育中 有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4 和Nanog 基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体，并在水 牛体细胞中表达，为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用，以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细 胞系（iPSC）奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA 和DNA，将RNA 反转录成第1 链cDNA，参 照牛基因序列（Oct4：NM_174580，Nanog：NM_001025344 ）设计特异性引物，采用RT-PCR 和PCR 分别扩增 Oct4 和Nanog 的编码区序列（the coding sequences，CDS ）和DNA 全长序列，其中Oct4 全长DNA 分3 段扩增，Nanog 全长DNA 分2 段扩增；利用生物在线分析软件对水牛Oct4 和Nanog 进行蛋白质结构预测和同源性比对；采用EcoR Ⅰ、Xhol Ⅰ和Xhol Ⅰ、Not Ⅰ双酶切，T4 连接酶，将Oct4 和Nanog 的CDS 连接到逆转录病毒载体pMX 上，构建逆 转录表达载体 pMX-Oct4 和 pMX-Nanog；采用组织块法培养水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblasts， BFFs ），逆转录表达系统经过病毒包装后产生的病毒上清液感染BFFs，感染12—15h 后，继续培养48 h；通过RT-PCR 和免疫荧光技术检测转基因在BFFs 中的表达情况。【结果】Oct4 CDS 全长 1 083 bp，编码361 个氨基酸，DNA 全 长4 509 bp，包括5 个外显子和4 个内含子；Nanog CDS 全长903 bp，编码301 个氨基酸，DNA 全长4 473 bp， 包括 4 个外显子和 3 个内含子；将Oct4 和Nanog 基因序列提交到 GenBank，分配的基因登录号分别为JN991003 和 JN991004；Oct4 氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为 98%、96%、91%和 81%，Nanog 氨基 酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为 90%、81%、69%和 47%；Oct4 和Nanog 蛋白结构与小鼠相应 蛋白的结构相似，分别含有本家族特有的POU 结构域和HOX 同源结构域；成功构建表达Oct4 和Nanog 的逆转录病 毒载体pMX-Oct4 和pMX-Nanog；逆转录病毒系统pMX 介导的Oct4 和Nanog 基因能转入BFFs 中，在mRNA 水平和 蛋白水平都表达，阴性对照中不表达。【结论】分别克隆了水牛Oct4 和Nanog 的DNA 序列全长和CDS，其基因序 列和氨基酸序列在物种间高度保守；逆转录病毒转基因方法将Oct4 和Nanog 基因成功地转入BFFs 并表达。逆转 录病毒系统介导目的基因表达的转基因方法可以应用于水牛转基因研究和水牛 iPSC 生产。 关键词：水牛; Oct4 基因; Nanog 基因; 克隆; 异位表达 Cloning of Buffalo (Bubalus bubalis) Oct4 and Nanog Genes and Ectopic Expression in Buffalo Fetal Fibroblasts DENG Yan-fei, LIU Qing-you, DENG Hai-ying, LUO Chan, YANG Su-fang, SHI De-shun (State Key Laboratory for Conserv