苏云金芽孢杆菌Vip3Aa10毒素结合肽的筛选及活性测定.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(18):3627-3634 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.18.006 苏云金芽孢杆菌Vip3Aa10毒素结合肽的筛选及活性测定 丁照鑫，王涵祎，曹利娟，郝艳同，申晓鸿，刘京国 （北京农学院生物科学与工程学院/农业部都市农业（北方）重点实验室，北京102206） Bacillus thuringiensis)在对数生长期产生并分泌到胞外的对鳞 摘要：【目的】Vip3A是由苏云金芽孢杆菌( 翅目昆虫有较广杀虫谱的毒素，其在敏感昆虫中肠上的结合受体尚未得到鉴定。利用噬菌体展示技术，论文试图 从肽库中筛选到能与 Vip3A 毒素特异性结合的多肽，为研究 Vip3A 毒素的杀虫模式提供线索。【方法】将构建的 pET28a-Vip3Aa10 表达质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导表达后，用亲和纯化的方法制备Vip3Aa10， 并用胰蛋白酶活化和离子交换层析进一步纯化。以活化的Vip3Aa10毒素为诱饵，经“吸附-洗脱-扩繁”4轮条件 逐渐严格的淘选，从噬菌体随机肽库中筛选能特异性地与活化的Vip3Aa10结合的噬菌体。以筛选到的噬菌体基因 组 DNA 为模板，经 PCR 扩增和测序，获得插入到噬菌体上的外源基因的序列，并推导出相应多肽的氨基酸序列。 将化学合成的多肽与活化的 Vip3Aa10 一起与甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)刷状缘膜囊泡共育后，用免疫印迹方 法检测多肽对活化的Vip3Aa10与BBMV结合的影响。将合成的多肽与活化的Vip3Aa10一起涂布在饲料表面，晾干 后，每孔放 1 只 1 龄的甜菜夜蛾幼虫。6 d 后统计昆虫死亡情况。【结果】在 25℃条件下用 IPTG 诱导含 pET28a-Vip3Aa10 质粒的大肠杆菌 BL21（DE3）可以表达出可溶性的 Vip3Aa10 蛋白。经亲和纯化、胰蛋白酶活化 以及离子交换层析后，可得到较纯的活化的 Vip3Aa10。以活化的 Vip3Aa10 为诱饵，经过 4 轮条件逐渐严格的淘 选，从十二肽库中筛选出9 条多肽，其中3条多肽的丰度较高，分别命名为P12-1、P12-2和P12-3，从七肽库中 筛选出5条多肽，其中1条多肽的丰度较高，命名为P7-1。结合试验和杀虫活性测定试验结果表明，P12-2和P7-1 多肽能不同程度地抑制Vip3Aa10与甜菜夜蛾刷状缘膜囊泡的结合，以及抑制Vip3Aa10 的杀虫活性。【结论】用噬 菌体展示技术筛选的多肽P7-1能显著性地抑制Vip3Aa10与刷状缘膜囊泡的结合，可降低35%以上的Vip3Aa10 的 杀虫活性。 关键词：苏云金芽孢杆菌；营养期杀虫蛋白；结合肽；筛选；活性分析 Screening and Activity Determination of the Binding Peptide of Vip3Aa10 from Bacillus thuringiensis DING Zhao-xin, WANG Han-yi, CAO Li-juan, HAO Yan-tong, SHEN Xiao-hong, LIU Jing-guo (College of Biological Science and Engineering, Beijing University of Agriculture/Key Laboratory of Urban Agriculture (North), Ministry of Agriculture, Beijing 102206) Abstract: 【Objective 】Vip3A, which is produced and secreted by Bacillus thuringiensis at the vegetative stage, has a wide spectrum