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宋晓娟：囊泡法转染噩射lFSII存巴斯德牛办酵母中的表达 囊泡法转染重组FSH在巴斯德毕赤酵母中的表达 研究生：宋晓娟 导帅：丁家桐教授 (扬州大学动物科学与技术学院江苏扬州225009) 摘要 成的球型或者椭球型的表面活性剂缔合结构，有一个水溶性内核。由于其与细胞 膜结构非常相似，现多用于细胞膜的模拟以及药物载体的制备。促卵泡素(FSH) 是一种对配子的发生、分化、成熟及与生殖有关行为的发生起重要作用的糖蛋白 激素。天然FSH制剂可广泛用于动物的生殖调控和人类的辅助生殖技术，但其来 断深入，为FSH高效、广泛地应用带来了契机。本实验室近年来一直致力于rFSH 长效表达的研究，不断寻求更利于提高体外rFSH表达量的方法和途径。本研究首 次使用，rFSH基因诱导囊泡的形成，并通过囊泡将目的基因转运至巴斯德毕赤酵母 表达系统并进行稳定表达，另外在酵母表达载体中引入报告基因EGFP，为高效表 达和检测重组FSH的长效表达基因提供了必备的条件。 根据囊泡的形成特点和制备方法，本实验选择十六烷基三甲基溴化胺(CTAB) 作为制备囊泡的主要原料，用限制性内切酶Sal 所得的线性载体诱导CTAB形成囊泡。通过PI染色对囊泡进行形态学观察。通过不 同浓度的CTAB对酵母细胞的毒性实验，考察囊泡法转染的可行性。在确定CTAB 并以电击转染法作对照，转染巴斯德毕赤酵母感受态细胞GSll5；然后采用营养缺 陷型的培养基、含抗生素的培养基及PCR的方法筛选阳性转化子His+及高拷贝转化 扬州人‘Z硕一lj’学化论文 2 异。 I和EcoRI双酶切后，再进行连接和 pPIC9K／FSHl3．CTP．0【经限制性内切酶SnaB 转化，从而构建了既含有目的基因又含有报告基因的酵母表达载体pPIC9K／ 击法转染GSI15感受态细胞，并用荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率。 CTAB形成囊泡，且通过囊泡包裹的方法转染巴斯德毕赤酵母表达系统，成功获得 了目的基因的有效表达。同时在载体中引入报告基因EGFP后，酵母细胞内可以 检测到绿色荧光信号，证明囊泡法转染效率较高。 本实验成功构建了同时含有目的基因和报告基因的酵母表达载体，并证实囊 泡法同电击法一样可以用于巴斯德毕赤酵母表达系统的转染研究，为进一步推广 重组FSH制剂和囊泡运载在生物学和医学等领域的应用提供了理论依据和参考价 值。 关键词：囊泡；重组促卵泡素；绿色荧光蛋白 宋晓娟：囊泡f』：转染醺组lFSH存巴斯德毕赤酵料中的表达 of Studies ofRecombinant Expression Hormoneviavesicles Follicle—-Stimulating 试Pichi倪P(Istoris M．S．candidate：XiaojuanSong Supervisor：Prof．JiatongDing Scienceand (Animal TechnologyCollege，YangzhouUniversity，225009) Abstract Vesiclesare or formed avolumeof sphericalellipsoidalparticles byenclosing solutioninasurfactant oftheirstructuressimilartocell aqueous