织纹螺肌肉中肌纤维结合型蛋白酶的分离纯化和性质分析.pdf

织纹螺肌肉中肌原纤维结合型蛋白酶的分离纯化 和性质分析 摘要 织纹螺属软体动物肉食螺类 ，在底栖群落中扮演重要的角色。 本课题以西格织纹螺为对象，对其肌原纤维自身降解的机理进行探 索，分离纯化了肌原纤维结合型金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶并进行 性质分析。此外，对织纹螺肌肉内源性丝氨酸蛋白酶抑制剂也做了 初步研究。 西格织纹螺肌原纤维在 5 5 ℃水浴加热处理时发生明显的自身 降解，其中肌球蛋白重链 （m y o s i n h e a v y c h a i n ，M H C ） 降解消失 ， 副肌球蛋白 （p a r a m y o s i n ，P M ）发生显著降解 ，而肌动蛋白仅发生 微弱的降解。 蛋白 酶抑制剂实验发现这种肌原纤维自身降解现象分 别受金属蛋白酶抑制剂 1 ，1 0- p h e n a n t h r o l i n e 和丝氨酸蛋白酶抑制 剂 B e n z a m i d i n e 部分抑制。 当 E D T A 和 B e n z a m i d i n e 共同存在时， 自身降解几乎被完全抑制。实验结果提示这种自身降解可能由内源 性肌原纤维结合型 金属蛋白酶和 丝氨酸蛋白酶 共同作用引起。织纹 螺肌原纤维热抽提处理制备得的粗酶液经过 D E A E - S e p h a r o s e 阴离 子交换柱层析，S P - S e p h a r o s e 阳离子交换柱层析和 P h e n y l - S e p h a r o s e 疏水柱层析，分离得到具有金属蛋白酶活力 的蛋白质，简称为织纹 螺 M B M P ( m y o f i b r i l - b o u n d m e t a l l o p r o t e i n a s e ，M B M P ) 。M B M P 的分 子量约为 4 5 k D a ，当以田螺肌原纤维为底物时 ，该蛋白酶的最适 p H 和温度分别为 p H 8 . 0 和 6 0 ℃，其肌原纤维降解活性可被 EDTA 、 E G T A 和 1 ，1 0- p h e n a n t h r o l i n e 完全抑制，而其它蛋白酶类抑制剂未 发现明显作用。将织纹螺肌原纤维热抽提制备的粗酶液经过硫酸铵 分级沉淀， S e p h a c r y l S - 3 0 0 凝胶过滤柱层析 ，羟基磷灰石柱层析和 S P - S e p h a r o s e 阳离子交换柱层析，可 部分纯化到一个肌原纤维结合 型丝氨酸蛋白酶，简称为织纹螺 M B S P ( m y o f i b r i l - b o u n d s e r i n e p r o t e i n a s e ，M B S P ) 。M B S P 的分子量约为 2 1 k D a ，以田螺肌原纤维 为底物测得该 M B S P 的最适 p H 和温度分别为 p H 8 . 0 - 9 . 0 和 5 5 ℃； 以荧光底物 B o c - P h e - S e r - A r g - M C A 测定结果为 p H 9 . 0 和 4 0 ℃。此 外，在织纹螺肌原纤维的热抽提液中还发现内源性丝氨酸蛋白酶抑 制剂，该抑制剂对织纹螺 M B S P 、鲫鱼 M B S P 和猪胰蛋白酶的 Boc - Phe - Ser - Arg- M C A 分解活性有不同程度的抑制作用。 关键词：织纹螺，金属蛋白酶，丝氨酸蛋白酶，分离纯化 i Purification and Characterization of Myofibril- bound Proteinases from the Muscle of Basketshell Nassarius siquinjorensis