家蚕解毒酶基因达调控研究.pdf

资助项目： 1. 国家蚕桑产业技术体系岗位科学家（家蚕生理及生态） （编号：CARS-22-ZJ0305 ） 2. 江苏省研究生科研创新计划项目（编号：CX2211-0108 ） 3. 苏州大学优秀博士论文选题资助专项（编号） 家蚕解毒酶基因表达调控研究 中文摘要 家蚕解毒酶基因表达调控研究 中文摘要 在自然界中，生物体不断地与外界环境进行物质交换，以满足自身的生长、发育 和生存需要。在这些物质中，有些是为了满足生物体营养所需，对生物体是有益的； 有些却对生物体的生命有危害。为了生存，生物体必须具备一定的生理、生化，甚至 是行为适应能力。通过体内的解毒酶系统催化分解代谢产物或异源物，起到解毒作用， 是生物体主要且常见的一种适应机制。昆虫的解毒酶是一类异质酶系，能够代谢大量 的内源或外源底物，这些解毒酶系包括：细胞色素 P450 酶系、谷胱甘肽-S-转移酶 系和酯酶等。 应用 geNorm 和NormFinder 软件首先对内参基因进行标准化分析以选择相对较 稳定的内参基因，是相对定量过程中比较关键的步骤，然而即使选择了相对稳定的内 参基因，由内参不稳定带来的误差仍是不容忽视的。而Dual spike-in qPCR 通过向样 品中加入外参基因，对目标基因进行全程跟踪标定，使校正结果较为准确。但是，该 方法需同时测定DNA 和RNA ，使得该方法的工作量提高一倍，增加了实验成本和时 间。为了解决这一问题，我们设想以Dual spike-in qPCR 首先对已标准化的内参基因 进行定量，再以此内参基因对目的基因进行校正的新的实验思路，结果表明该方法在 能得到较准确定量结果的同时，降低了实验的工作量和成本，为实时荧光定量 PCR 技术的进一步发展提供了新的参考。 为了从宏观上解析家蚕体内主要解毒酶基因的分布情况以及外源物质对解毒酶 基因转录水平的影响，我们采用Dual spike-in qPCR 方法，测定了家蚕正常情况以及 分别添食蜕皮激素和芸香苷条件下各组织中主要解毒酶基因的转录水平。结果表明： 中肠中参与蜕皮激素代谢的基因相对较少，BmGST 基因主要参与了中肠对芸香苷的 代谢。脂肪体中参与蜕皮激素代谢的基因主要有CYP9a20, BmGSTo 1, BmGSTz2 等； 参与芸香苷代谢的基因较多，以BmGST 基因为主。马氏管中参与蜕皮激素代谢的基 因主要有 CYP6ab4, BmGSTs2, BmCarE 15 等；参与芸香苷代谢的基因主要有 BmGSTo 1。 I 中文摘要 家蚕解毒酶基因表达调控研究 为进一步了解家蚕解毒酶基因的生理功能，本研究选择了三个主要解毒酶基因： CYP6ab4 、BmGSTd 1、BmCarE-10 。对上述基因设计了3 个不同位点的siRNA，通过 转染BmN 细胞的方法筛选出干扰效果最显著的siRNA 片段。结果表明：CYP6ab4-928 ， BmGSTd 1-405，BmCarE-10-519 的干扰效果最为显著，分别使各自干扰基因的转录水 平下降到对照的 26.5% ，39.6%和 17.9%，可用于进一步的体内RNAi 实验。对家蚕 五龄幼虫注射有效干扰siRNA 片段，通过实时荧光定量PCR 测定并分析经RNAi 后 家蚕解毒酶基因在中肠、脂肪体和马氏管3 种组织中转录水平的变化。结果表明：家 蚕五龄幼虫通过注射 siRNA，3 种被测基因表达都能够被成功抑制，且注射后 48 h 比24 h 效果更为明显。为了解家蚕解毒酶基因RNAi 后虫体对辛硫磷的抗性差异， 对家蚕 5 龄幼虫分别注射 siRNA 片段后，添食浸有辛硫磷的桑叶，调查统计了不同 处理下的累积致死率。结果显示：分别注射三个解毒酶基因siRNA 48 h 后添食辛硫 磷导致的虫体死亡率显著增高，分别达到88%、84%和89%。 为研究家蚕主要解毒