《2016-6第三章 第二节蛋白质定量测定0408》.pdf

第二节 蛋白质分析方法 1 • 化学分析法：定氮法 • 光谱分析： • 利用蛋白质的共性，如含 UV-Vis： 氮，含肽键和折射率等性 荧光 质测量蛋白质的含量； 共振光散射 • 电分析 • 利用蛋白质中某些特定的 氨基酸残基、芳香基团、 酸性和碱性基团等测量蛋 白质的含量。 2 • 1. 凯氏定氮法] • 1833年 凯 氏定 氮 法 • 常量法、微量法、自动定氮仪法、半微量法及改良 凯氏法等多种。 • 利用一般蛋白质含氮量平均在16%，可将测定的含 氮量折算成样品中蛋白质的含量。 优点是适用范围广，可用于动植物的各种组织、器官及食 品等组成复杂样品的测定，但操作比较复杂，含大量碱 性氨基酸的蛋白质测定结果往往偏高。 • 国家标准的检验方法为凯氏微量蒸馏法。该标准适用 于商品粮食、油料中粗蛋白质的测定。 3 ① 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化 为无机氮——硫酸铵。加硫酸铜（催化剂）和硫 酸钾（提高硫酸沸点）的混合物可加快反应；视 样品的性质这一步需30min至1h。 ② 加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成NH4OH, 加 热后生成NH3, 通过蒸馏导入过量酸中和生成 NH4Cl而被吸收。 ③ 滴定：用过量标准HCl吸收NH3，剩余的酸可用标 准NaOH滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的 NaOH摩尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。此法为回 滴法，采用甲基红卫指示剂。 • HCl＋NaOH=NaCl +H2O • 本法适用于0.2 -2.0 mg的氮量测定。 4 2. 浊度法比浊法 • 利 用 沉 淀剂与蛋白质反应产生的浊度与标 准溶液浊度比较而定量测得未知蛋白质浓度的 定量分析法。 • 磺基水杨酸、三氯醋酸、三氯化铁，作为沉淀剂 可沉淀白蛋白、球蛋白及血红蛋白，测定悬浮液 的浊度。 • 操作简单、快速、试剂易购， 目前仍为临床 常规检查所用。 • 影响因素太多。 5 3. 紫外光谱法 利用吸收光谱对物质进行定量分析 6 紫 外 光 谱 法 7 3.1 280nm的光吸收法 • 蛋白质分子中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸在 280nm处具有最大吸收，各种蛋白质的这三种氨 基酸的含量差别不大。 • 石英比色皿， • 溶剂（水或缓冲液）作空白测定A280 • 蛋白质浓度0.1-1.0mg/ml。 •