家蚕丝氨酸羧肽基因的克隆分析及其与卵黄蛋白的关系研究.pdfVIP

中文摘要 家蚕丝氨酸羧肽酶基因的克隆分析及其与卵黄蛋白的关系研究 中文摘要 羧肽酶是昆虫体内重要的消化酶系之一，而到目前为止，仅有少量关于昆虫 丝氨酸羧肽酶（seine carboxypeptidases，SCP ）的描述，家蚕中未见相关研究报道。 根据组织器官的差别，丝氨酸羧肽酶所发挥的功能存在差异，从消化食物乃至到 合成神经内分泌肽等，都存在有丝氨酸羧肽酶的作用。本实验基于家蚕 SAGE 文 库分析筛选出一个高温与常温表达差异显著基因——丝氨酸羧肽酶基因，并从家 蚕 5 龄幼虫脂肪体中克隆了该基因，对该基因序列进行生物信息学分析，调查了 在常、高温条件下，该基因在不同发育阶段的表达规律，进一步分析该基因与卵 黄蛋白的关系。获得了以下研究结果： 1 家蚕丝氨酸羧肽酶（SCP ）新基因cDNA 的克隆及其分析 基于本研究室构建的常、高温条件下家蚕幼虫组织 SAGE 表达文库，以雌性 幼虫高温处理后显著低表达 Tag (CATGGTGCCGCGGGACCAGCC)为线索，根据 SAGE 文库中的注释信息获悉目的基因在家蚕基因组数据 （/silkdb/ ）中的基因登录号为 BGIBMGA012773-TA ，使用 RACE 技术，将其 mRNA 序列由原来预测到的 1416bp 延长至 1671bp，3’RACE 延长了85bp，其中最长 ORF 1416 bp 。通过构建分子进化树进一步分析，表明家 蚕 BmSCP 基因与大红斑蝶的EHJ78980.1 基因的进化距离最近，形成同一分支， 与其他昆虫的SCP 在进化关系上相对较远。通过家蚕SCP 与脊椎动物以及其他物 种中的SCP 进行蛋白序列比对分析发现，高等脊椎动物乃至昆虫间SCP 的氨基酸 残基具有较高保守性，存在较多的氨基酸相似位点，说明该蛋白在漫长的进化过 程中保守性较高，并具有较高的种间相似性。5 龄3d 的幼虫不同组织表达实验与 EST 表达谱存在差异，BmSCP 基因不仅在脂肪体中表达，而且还在多个组织中均 有表达。通过分析初步鉴定该基因为家蚕中未报道过的丝氨酸羧肽酶基因(SCP) 。 2 高温处理对家蚕BmSCP 基因的表达影响及特异性分析 分别提取 5 龄时期常温和高温条件下不同性别不同发育期家蚕的脂肪体和中 家蚕丝氨酸羧肽酶基因的克隆分析及其与卵黄蛋白的关系研究 中文摘要 肠组织mRNA ，通过荧光定量PCR 的方法，调查在常温和高温处理条件下，不同 性别不同组织中BmSCP 基因的表达状况。结果表明，在雌性家蚕5 龄幼虫脂肪体 中，高温组对比与常温组之间，BmSCP 基因表达有显著差异，而在雄性中仅在 5 龄5d 天时存在显著差异；而在家蚕中肠组织中，与常温组相比，雌性和雄性分别 在5 龄7d 天和5 龄3d 天存在显著差异。上述结果说明，BmSCP 基因是一个高温 敏感基因，并且BmSCP 基因在雌性家蚕脂肪体中的敏感性明显高于雌性中肠、雄 性脂肪体和中肠中。 无论是常温组还是高温组，BmSCP 基因在家蚕脂肪体的表达存在显著性别差 异，也就是说这种性别间差异表达规律与饲育温度没有直接关系。而在家蚕中肠 中，BmSCP 基因表达不存在明显的性别差异。推测 BmSCP 基因在雌蚕脂肪体中 存在一种特殊功能，可能与雌蚕生成卵内所需的营养物质储存和转化相关。 不同发育阶段BmSCP 基因组织差异表达分析显示，在雌性家蚕中BmSCP 基 因表达存在显著组织差异，发现BmSCP 基因在5 龄期中肠中也存在高表达，进一 步佐证了Peter 等关于丝氨酸羧肽酶在昆虫中肠中存在消化功能的推测，。 3 家蚕BmSCP 基因与卵黄蛋白的关系 家蚕卵从开始成形到产下卵共8d，分析家蚕卵巢、卵中卵黄蛋白（Yolk protein ， YP ）含量与BmSCP 基因的表达的关系，试验结果显示，YP 的波动趋势与BmSCP 基因的表达趋势相一致，推测 SCP 基因及其相应的酶可能参与YP 的合成。同时 发现在 5 龄发育阶段，雌蚕脂肪体中 SCP 转录与卵黄原蛋白受体(Vitellogenin receptor/ yolk protein receptor ，VgR/ YPR)基因转录表达趋势一致。推测SCP 基因 及其相应的酶不仅