动物DNA提取实验.pptVIP

背景材料 高等动物、植物的基因组相当宠大， 如人类细胞基因组由30亿个碱基对组成，包含了该物种生长，发育，繁殖等各项生理活动的几乎全部信息量，获得纯度高、基因组相对完整的基因组是以后PCR分析，基因文库的构建，基因探测等的研究的基础。 实验目的 1：了解动物基因组DNA的一般提取。 2：通过动物组织DNA的提取，掌握DNA 提取的方法和步骤 DNA提取原则 1：保证DNA结构的完整性 2：纯化后不应存在对酶有抑制作用的物质 3：排除有机和金属离子的污染 4：蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 5：排除其他核酸分子的污染 溶剂 实验原理 DNA与蛋白质结合成脱氧核糖蛋白（DNP），能溶解在纯水或1mol/L的NaCl溶液中，而不溶于有机溶剂。 SDS法提取动物组织DNA SDS（十二烷基硫酸钠 ）是阴离子表面活性剂，溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA 抑制DNA酶的活性。再加入氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。上清液中加入乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于双蒸水或TE溶液中，即DNA溶液。 实验步骤 1．组织块解冻，用生理盐水洗去血污，剪取约0.5g组织，放入1.5ml离心管中，剪碎。 2．加入0.45ml TES混匀，再加入50ul SDS（10%），5.0ul蛋白酶K（20mg/ml），充分混匀后，于56°C保温4-6h，每2h摇1次。 3．放置到室温，加入等体积饱和酚（500ul），颠倒混匀，10000r/m，离心10m，分离水相和有机相，小心吸取上层含核酸的水相，到一个新的1.5ml离心管。 实验原理 4．加入等体积酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层转移到新的1.5ml离心管中。 5．加入等体积氯仿：异戊醇（24：1），颠倒混匀，10000r/m，离心10分钟，取上层清液到一个新的1.5ml离心管。 6．加入2.5倍体积的-20°C预冷的无水乙醇沉淀DNA，观察现象。 7．12000 r/m，离心10分钟，弃乙醇。 8．-20°C保存的75%乙醇洗涤，10000 r/m，离心5分钟，去乙醇，55°C干燥DNA。 9．加入适量TE溶解DNA（具体依DNA的多少而定），-20°C保存备用。 注意事项 1．抽提每一步用力要柔和，防止机械剪切力对DNA的损伤。 2．取上层清液时，注意不要吸起中间的蛋白质层。 3．乙醇漂洗去乙醇时，不要荡起DNA。 4．离心后，不要晃动离心管，拿管要稳，斜面朝外。 * *