副溶血弧菌耐热接溶血素基因的克隆表达与鉴定.pdfVIP

福建农林大学硕士论文 摘要 根据已发表的副溶血弧菌耐热直接溶血素(Ⅱ)H)的核苷酸序列设 计了一对引物，并在5’-端与3’．端分别增加BamHI和EcoRI酶切位点， 应用PCR技术从致病性副溶血弧菌wVp2株扩增了tdh基因，PCR产物经 BamHI、EcoR I双酶切回收后定向插入p(HⅨ．4T-l表达载体，测序分析 5．0、 组成、分子量为23kDa的耐热直接溶血素。应用DNAman、Antheprot 有一碱基差别(A-G)；推导的氨基酸仅123位由天冬氨酸替代了TDHl 的甘氨酸，同源率达99．47％，前24个氨基酸是较强的琉水性区域，可能 组成信号肽。 DH5 将PCR产物与pGEX-4T-1构建的重组质粒成功的转化了E．coil 在迁移率为49kD位置上出现一条明显的蛋白带，而其载体自身带有26kD GST蛋白带消失，由此推断，49kD蛋白是由tdh基因编码的23kD蛋白 Doe2000, 与g甜基因编码的26kD蛋白连接后形成的融合蛋l自,Bio-radGel QuantityOne软件分析表明该融合蛋白的表达量占菌体总蛋白宙量的32％， 表达产物主要以不溶性蛋白的形式存在于菌体裂解沉淀中，利用5mM二 硫苏糖醇、1．5％十二烷基肌氨酸钠和0．2％脱氧胆酸钠等变性趔对不溶性 蛋白处理后，能使大部分不溶性蛋白转变为可溶性蛋白。通过Oluta：吐Iione Sephrose 工程菌分离出来。免疫学分析证实纯化的表达产物能被副溶血弧菌胞外产 物的特异性抗血清所识别，抗血清的ELISA效价为1：32000，当抗血清稀 和免疫学分析证睨所克隆的基因是融溶血弧藏的自蕊基因。置震组萄表达 福建农林大学硕士论文 的TDH与原始菌株产生的TDH抗原性一致。副溶血弧菌的tdh基因克隆 与表达，为在单因子水平上研究副溶血弧菌TDH的毒力、致病机理以及 诱导宿主免疫应答方面的作用奠定基础。 关键词：副溶血弧菌耐热直接溶血素TDHtdh克隆表达纯化 鉴定 福建农林大学硕士论文 Inthis and ofthermostabledirect paper，thecloningexpressing V／brio of hemolysin(tdh)of pair werc tothe withrestriction sites primers enzymecutting designedaccording nucleotide ofa tdhof the published sequenceputative V．p．Withspecific about fromVibrio primers，atargetfragement570bpw∞amplified ofBamI-IIandEcoRJ。me sUain．晰th恤cleavage wVp2 parahaemolyticl