大肠杆菌o15喹诺酮类耐药相关机制的研究.pdfVIP

中文摘要 大肠杆菌0157：H7是医学和兽医学临床感染中常见的病原菌之一，建立快速 检测方法对食品安全和人类健康具有重要意义。大肠杆菌0157对多种抗菌药物 耐药主要与菌体中存在的外输泵有关。一般认为AcrAB-TolC外输泵是最主要的 外输泵，能够输出多种抗菌药物、化疗试剂、洗涤剂和染料类。如果使该系统失 活，大肠杆菌0157可从多重耐药状态变为相对敏感状态。本实验通过建立大肠 杆菌0157：H7的快速检测方法，研究大肠杆菌0157：H7对氟喹诺酮类药物的基因 突变耐药机制，检测临床分离的动物源性大肠杆菌0157的acrA、acrB基因的 重耐药水平的相关性。 研究快速、特异、灵敏的检测肠出血性大肠杆菌0157：H7的多重PCR、荧光 定量PCR方法并比较单一PCR和多重PCR、荧光定量PCR对检测灵敏度的影响。 选择0157：H7的0抗原、H鞭毛抗原及睨刀和睨刀毒素基因特异的4对引物， 后比较PCR的检测灵敏度。同时设计TaqMan荧光探针进行荧光定量PCR进行灵 选用临床分离的4株耐药菌、实验室诱导培养获得的3株耐药菌和1株敏感 菌，提取其染色体DNA，PCR扩增gyrA和parC基因片段，并将其克隆和测序。 结果表明，无论是临床分离的还是实验室诱导的耐药菌，gyrA基因在其编码第 83位或第87位氨基酸处均发生突变，parC基因在其编码第80位或第84位氨基 酸处发生突变，而敏感菌ES在2个基因位点上均未发生突变。其中2株低度耐 药菌株的gyrA基因出现单一突变，使其编码的氨基酸发生改变，分别为 Glu84突变可能与大肠杆菌0157的氟喹诺酮类药耐药机制有关，且低度耐药只 在gyrA基因上出现单一位点突变，当高度耐药时，才同时在parC基因上出现突 变，gyrA，parC是大肠杆菌0157：H7耐氟喹诺酮类药物的基因标识。 转录产物量相当的内参稀释度与大肠杆菌0157EDL933的反转录产物量相当的内 参稀释度做比较的结果表明：高水平耐药与EDL933菌株的acrA；口咖的mRNA 一菌株的a洲、acrB基因的mRNA的水平基本一致，可能是由于二者由一个操纵 子调控的原因。a洲、acrB是大肠杆菌0157：H7多重耐药的基因标识，其mRNA 转录水平与大肠杆菌0157：H7的多重耐药水平呈正相关性。 本研究结果表明，多重PCR和荧光定量PCR可对大肠杆菌0157：H7进行定性 和Glu84突变可能与大肠杆菌0157的喹诺酮类药耐药机制有关，且低度耐药只 在gyrA基因上出现单一位点突变；当高度耐药时，才同时在parC基因上出现突 的：与敏感株相比，a刚的mRNA水平与其蛋白表达水平基本一致：多重耐药大肠 杆菌0157的mRNA和蛋白表达水平与其耐药水平有一定的相关性。 关键词：大肠杆菌0157：H7，荧光PCR，gy_rd,parC Ⅱ Abstract 0157lSoneofbacteriainmedicalscienceand E．coli veterinary methodhas tofoods andhumanhealth．AcrABeffiux a significance important safety pumpplays roleintheantibioticsresistance ofEsherichiacoli01 antiobiotics major phenotype 57，multitiple resistancemutant．AcrAB·TOICcalleffiuxOUtan wide of system antibiotics， extraordinarilyvariety and coordinatedoftheinnermembrane chem