5-fu富集支管上皮细胞株干细胞群体的分子机制研究.pdfVIP

·中文论著摘要· 5．FU富集支气管上皮细胞株干细胞群体的 分子机制研究 刖 蟊 先天性气管狭窄或闭锁、肺部恶性肿瘤使气管的结构和功能造成严重损伤， 需外科重建。但异种移植无法避免排斥反应，需终生应用免疫抑制剂，增加了感 染及患肿瘤的危险性。如能使用气管干细胞移植，重建完整的气管上皮，则给上 述患者的治疗带来希望。 在正常的支气管上皮为阴性表达。在5．FU处理之后，正常的增殖期气管上皮脱落， 生了再编程，而后干细胞分化为纤毛细胞、粘液细胞或基底细胞，此时Oct3／4、 气管干细胞的标志物，那么为什么在损伤修复过程中出现有规律的变化呢?进一 去甲基化，组蛋白乙酰化，染色质重塑，这些已在大鼠及人支气管器官实验中得 到证明。本研究观察经5一FU处理后，富集分离人支气管上皮细胞株中的干细胞， 并解析干细胞的生物学特点。 材料和方法 一、材料与试剂 人支气管上皮细胞株HBE由本实验室培养传代，实验中所用为生长状况良好 的细胞。细胞培养液为含10％胎牛血清的RPMI．1640培养液，培养条件为37℃、 茂生生物科技发展有限公司。无支原体胎牛血清、砌，MI．1640培养基、0．25％胰蛋 隆抗体、Sox2单克隆抗体、P63单克隆抗体、p．catenin单克隆抗体、Alphafetoprotein 单克隆抗体、人肌动蛋白actin(SM)单克隆抗体、人微管蛋白III单克隆抗体、 胰岛素、ECL化学发光试剂盒、Westem细胞裂解液、考马斯亮蓝。 二、方法 1、MTT实验 将单个细胞悬液接种于96孔板中，每孔含103个细胞，培养24h，空白孔和 对照孔分别加入200ul培养基，干预孔加入化疗药物和培养基，继续培养至干预 后的相应时间点进行0D值的测定。每孔加入MTT溶液继续培养4h，加入DMS0， 490m波长下测定各孔光吸收值，以不含细胞的空白孔做对照。计算抑制率，绘 制细胞生长曲线。 2、流式细胞仪分选sP细胞 消化细胞成单细胞悬液，调整细胞密度至1×106／mL，待分选细胞分两组处理： 一组避光加入终浓度为5p∥m1 标记死细胞。流式细胞仪分选SP细胞：Hoechst33342染料在350m处被激发， 发射光蓝光424nm／BP44，红光660nm／BP20。 3、细胞免疫荧光 h 将细胞接种于24孔板中培养生长。贴壁后按40¨∥ml的浓度加入5一FU，24 后测免疫荧光。4％多聚甲醛室温固定15min。TritonX．100处理，血清封闭后分别 2 观察结果。 4、Westem印迹实验 收集5．FU作用前后的HBE细胞，按蛋白抽提试剂盒说明抽提细胞总蛋白， 发光法显影成像。相同条件下用B．actin作为内对照。 5、集落形成实验 消化细胞成单细胞悬液，将细胞做梯度倍数稀释，按每皿50、100、200个细 ml 胞的密度分别接种于含10 37℃预温的培养液中。在37℃、5％C02饱和湿度培 养箱中培养14天。14天后，终止培养，加入纯甲醇5ml，固定15min。去固定 液，加Giemsa应用染色液染30min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。计 算克隆形成率=克隆数／接种细胞数×100％ 6、无血清+生长因子悬浮培养富集干细胞 DMEM／F12无血清培养液中悬浮培养。每2天加1次生长因子，1周换液2次，培养2 周。每天观察经5一FU处理前后的HBE细胞在无血清培养液中形成干细胞球的过程。 7、裸鼠移植实验 PBS，进行接 选择5周龄的雄性裸鼠，5．FU处理前后细胞按5×105个／200“1 种。每周观察2次，移植4周后给裸鼠施行安乐死。称量肿瘤大小，重量，拍照。 肿瘤切取后常规4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，制作病理切片，HE染色，免疫组 织化学染色。 8、脏染色 标本用中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成4岬切片。二甲苯、梯度酒 精脱蜡至水，