ag85a基因饰的树突状细胞疫苗抗膀胱癌的实验研究.pdf

·中文论著摘要· A985A基因修饰的树突状细胞疫苗抗膀胱癌的 实验研究 实验目的 膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤。膀胱肿瘤的发生和复发主要与机体免疫功 能低下、肿瘤细胞逃逸机体的免疫监视有关，如何提高膀胱肿瘤患者的免疫功能 成为治疗和预防膀胱肿瘤复发的关键，因而肿瘤的免疫治疗方法越来越受关注。 肿瘤特异性免疫治疗的基础是肿瘤细胞具有抗原性并能引起机体的免疫应答。抗 肿瘤免疫主要是T细胞介导的细胞免疫，有效的抗原提呈，是机体抗肿瘤免疫的 始动因素。肿瘤细胞由于MHC．I类分子表达低下及共刺激分子的缺乏，导致自 身提呈抗原能力低下，肿瘤特异性T细胞的激活必需依赖于抗原提呈细胞的帮助。 cell 树突状细胞(DendriticDC)是体内唯一能够激活初始T细胞的抗原提呈细胞， 是启动、调控并维持免疫应答的重要环节。有研究表明，恶性肿瘤细胞在患者体 内释放的免疫抑制因子能抑制DC的生物学活性，使其不能有效提呈肿瘤抗原激 发机体的抗肿瘤免疫，导致肿瘤细胞的逃逸。更有实验证实在膀胱肿瘤组织中浸 润的DC成熟受抑，共刺激分子CD80、CD86的表达下调，可能是其发生免疫逃 逸的机制之一。因此研究以DC为基础的DC疫苗免疫治疗方法将成为膀胱肿瘤 治疗和预防复发的有效手段。 制备DC疫苗的基本方法是将肿瘤抗原负载DC。而DC疫苗有效性的首要前提 是DC具有正常的生物学功能。促进DC的成熟、增强其功能则是提高DC疫苗免疫 效果的重要手段。将细胞因子基因导入DC或通过细菌DNA序列CpG刺激、HSP冲 激DC等方法均能促进DC的成熟，从而促进其抗原提呈功能，提高DC疫苗免疫效 NK细胞、单核-巨噬细胞的肿瘤杀伤活性。A985A基因转染的DC疫苗已用于抗结 核的实验研究，但以此转染的DC疫苗用于膀胱癌的研究国内外尚无报道。本研究 转染的DC免疫生物学特性的变化，并以A985A基因修饰I拘DC2．4负载膀胱肿瘤抗 原制备DC疫苗，观察其在体内外对膀胱肿瘤的免疫学效应。 实验方法 1、重组质粒pcDNA3．1／myc—hisA-A985A的构建及转化 coli 杆菌E DH5a，提取质粒经酶切电泳鉴定和测序证实。 2、重组质粒pcDNA3．1／myc—hisA—A985A转染DC2．4 采用lipofectamine 后收获瞬时转染细胞。瞬时转染48小时后按筛选试验中所确定的最佳G418浓度 (500删m1)加入G418进行稳定转染细胞的筛选，持续筛选3周后获稳定转染细 胞株，即DC．A985A、DC-pcDNA。 mRNA表达 3、RT-PCR法检测瞬时及稳定转染DC67A985A 表达。 4、MTT法检测转染DC束IJ激T细胞增殖能力 转染的DC2．4细胞，加入丝裂霉素C灭活，调整细胞浓度为4x105／ml，作为刺激 细胞。制备C57BL／6小鼠脾细胞悬液，红细胞裂解液溶解红细胞，尼龙毛柱分离 T淋巴细胞，调整细胞浓度为2x106／ml，作为反应细胞。在96孔细胞培养板中， 48h、72h和96h，MTT法检测。 2 亚 抗．MHCII．PE单克隆抗体冰浴30min，流式细胞仪检测。 6、MB49粗提抗原及负载肿瘤抗原DC疫苗的制备 收集对数生长期的MB49细胞，反复冻融离心，取上清，制备粗提抗原。将 DC．pcDNA疫苗和DC2．4疫苗。 应 灭活。灭活的DC按照1：10的比例与分离的C57BL／6小鼠脾T淋巴细胞共培养， 并以未经DC刺激的T淋巴细胞作为对照。培养72h收集悬浮细胞即为DC疫苗 刺激的效应T细胞。以对数生长期的MB49细胞作为靶细胞，浓度为4x105／ml。 按效：靶等于10：1加入96孔板，同时以单纯效应细胞和单纯靶细胞作对照，培 养72h，MTT法检测。 水平 采用ELISA法对上述各组DC疫苗刺激的效应细胞上清IFN．7的含量进行检 Pr04．3．1 测，酶标仪检测450nm处OD值，应用SoftMaxLS软件分析，绘制标准 品曲线，计算样品中I