pcr法检测硅ssu基因在溺死鉴定中的应用.pdfVIP

删lllI|㈣㈣㈣㈣呲 Y261 8343 硕士学位论丈 PCR法检测硅藻SSU基因在溺死鉴定中的应用 硕士研究生：余政梁 导师：刘超主任法医师 撬要 目的：溺死(drowning)是机械性死亡的一种。我国河道水网密集，水中尸 体多发，在江河湖海中发现的尸体可能属于意外溺水死亡，但也可能为自杀或 他杀，也不排除死后抛尸入水伪造意外溺水身亡，因此水中尸体可能与刑事案 件相关，必须进行法医学鉴定。溺死的鉴定及对其实用性、科学性的评价是法 医学领域长期以来的重要课题之一。确定生前入水和死后入水是解决溺死类案 件的关键，由于其他生物学和尸体化学的溺死检验指标尚未得到科学的确认， 因此，硅藻检验仍是目前鉴定溺死的“金标准”。近年来，对溺死的相关报道主要 集中于不同水域溺死案件的鉴定或回顾性研究，且主要着重于尸体脏器中硅藻 的检出及检出率比较，对传统硅藻提取、检测方法的改良及优缺点比较，而忽 略脏器内硅藻种类与溺死地点硅藻种类的比较及新的、灵敏度高、特异性强的 硅藻检验方法的探索。本研究主要通过酶消化法分离硅藻，在保证操作者安全 的同时，减少硅藻的破坏和损失；硅藻DNA的提取使用MoBio强力土壤DNA DNA Isolation 提取试剂盒(PowerSoiITM Kit)，能高效提取硅藻基因组DNA，且 DNA纯度高，可直接用于下游实验；选用硅藻特异性引物，通过PCR法扩增硅 藻SSU基因，通过琼脂糖凝胶电泳及PCR产物测序，验证引物特异性。DHPLC 法不仅可以对PCR产物的片段大小进行分析，还能对PCR产物的构象及碱基组 成比例进行检测分析，因此本研究采用DHPLC法(高效变性液相色谱法)对溺 死人体脏器及溺死地点水样中的硅藻进行分析，区分不同水域硅藻种属，为判 断溺死人体脏器内硅藻种属与溺死地点硅藻种属是否相同提供依据，具有灵敏 度高、特异性强的优点。此外，本研究中还应用了毛细管电泳检测硅藻ssU基 因，此法也具有灵敏度高、特异性强的优点，毛细管电泳法因其应用广泛、操 中文摘要 作简单，因此在溺死鉴定和溺死地点推断中易普及推广，为硅藻检验提供了～ 种新方法、新思路。 方法：把实验动物60只随机分成3组，分别为生前溺死(水中溺毙)、死 后入水(空气栓塞致死后入水)、对照组(空气栓塞致死后不做处理)，每组20 只：从广州市刑事科学技术研究所获取溺死诊断阳性人体脏器组织30份，包括 肺、肝、肾组织，提取各组织检材硅藻DNA，PCR扩增硅藻特异的核糖体小亚 值。 结果：在动物实验中，生前溺死组肺、肝、肾硅藻检出率分别为100％、90％、 85％，死后入水组仅肺检出硅藻(15％)，对照组各组织均为阴性：生前溺死组 检出率明显高于死后入水组(P0．05)。通过PCR．CE法对20只溺死实验动物的 肝、肾、肺进行检验，结果发现随着检材量的增加，检出的硅藻种类数增加， 且均存在正相关；肺内检出硅藻种类与检材量的相关系数是0．433(P0．01)，肝 内检出硅藻种类与检材量的相关系数是0．623(PO．01)，肾内检出硅藻种类与检 材量的相关系数是0．613(PO．01)。当检材量大于0．9g时，肺内检出硅藻种类 以2种及2种以上为主；当检材量大于1．5 g时，肝内检出硅藻种类以1种及1 种以上为主；当检材量大于2g时，肾内检出硅藻种类以1种及1种以上为主。 20例溺死诊断阳性的人体器官组织检材用PCR．CE法检出硅藻种类明显多于微 波消解．扫描电镜法(PO．05)。10例溺死诊断阳性的人体器官组织检材用DHPLC 法检出硅藻种类明显多于微波消解．扫描电镜法(P0．05)。 结论：PCR．DHPLC法是一种新的诊断溺死的方法，