pi3kakt号传导通路在血管瘤发生发展中的作用及靶向该通路治疗血管瘤的实验研究.pdf

·中文论著摘要· P13刚AKT信号传导通路在血管瘤发生发展中的作用 及靶向该通路治疗血管瘤的实验研究 目 的 血管瘤是一种常见的血管内皮肿瘤，在我国的发病率约为0．3％～1％，具有 一系列广泛的临床表现。从良性的婴幼儿血管瘤，恶性度低的血管内皮瘤，到多 发于成人的恶性血管肉瘤。血管瘤及相关的血管畸形可见于多种先天性遗传性疾 病，通常伴有多种组织器官发育缺陷。到目前为止，血管瘤形成的分子及细胞学 机制仍然不清。与正常血管内皮细胞相比，血管瘤内皮细胞增殖、侵袭能力增强。 血管内皮细胞过度增殖，病理性血管生成是血管瘤形成的主要生物学行为。 P13刚Akt信号转导通路在广泛的人类肿瘤谱中失调，该通路某些成分的突变所 导致的功能获得或功能缺失能够引起细胞转化，该通路是调节内皮细胞生存、血 管生成的主要信号调节途径，在血管瘤中表现出异常激活。VEGF是该信号通路 主要的信号刺激因子。AKT是该信号通路的中心调控点，其完全磷酸化由Thr308 和Ser473磷酸化组成。AKT 则由mTORC2磷酸化激活。AKT完全磷酸化是其发挥生物学功能所必需的。哺 乳动物AKT有三种亚型：Aktl，Akt2andAkt3。这三种亚型由严格区分却又高度 同源的基因编码。特异性AKT亚型基因敲除鼠研究表明，不同AKT亚型表现 出不同的功能。目前，AKT亚型特异性功能研究成为肿瘤研究中的热点。雷帕 抑制作用，动物研究表明，雷帕霉素可以显著抑制实体瘤中AKT的活性及病理 性血管生成。本研究探讨血管瘤中AKT信号传导通路的调节作用；通过慢病毒 这两种AKT上游激酶对AKT活性及血管瘤的生长、增殖及侵袭的影响及其作 用机制；探讨低剂量雷帕霉素对血管瘤的治疗作用；探讨AKT三种亚型对良、 恶性血管瘤生长、增殖、侵袭的影响及其作用机制。 实验材料 实验用EOMA细胞，293T细胞由哈佛医学院，LauraBeniamin实验室提供， 婴儿血管瘤组织、原代婴儿血管瘤内皮细胞、人皮肤微血管内皮细胞、ASM．5 细胞及正常人皮肤组织、小鼠血管内皮细胞由哈佛医学院CarolePeHuzzi友情赠 送及技术支持。实验动物为裸鼠，4．6周，雌性(CharlesRiver，MA)。实验所用 AKT信号通路相关抗体、VEGF／VEGF受体等抗体均购于Cell Si印aling Techn0109y。LY-294002(L9908)购于Sigma。 实验方法 1、慢病毒介导的shIⅢA靶向基因沉默 慢病毒表达载体中。该质粒由哈佛大学Lesliewardwell，RNAiFacilitv， Dana．Farber 胞。 2、Wrestem Blot方法检测各种蛋白激酶激活及表达情况。 细胞经含有蛋白酶及磷酸酶抑制剂的细胞裂解液作用后，提取细胞总蛋白， 泳后转移至硝酸纤维素膜，加入适当比例稀释的一抗孵育过夜，第二天加入HRP 标记的二抗作用后，进行膜孵育及曝光检查蛋白表达情况。 3、利用WST-1细胞增殖检测法检测血管瘤细胞增殖能力。 4、Transwell Matrigel方法检测血管瘤细胞侵袭转移能力。 5、体外出芽实验检测血管瘤细胞新生血管形成能力。 6、免疫组织化学方法检测几种人类良、恶性血管瘤中AKT Ser473位点磷酸化表达情况。 姑 里 ：口刁≮ 1、人血管瘤中AKT磷酸化活性异常增高 福尔马林固定，石蜡包埋的人良、恶性血管瘤组织经AKT磷酸化Ser473 位点的抗体染色，结果表明，与邻近的正常血管组织比较，在所选血管瘤组织中， 都表现出A1盯Ser473磷酸化表达增强。 种业型的表达 Westem Blot结果表明，shRNA成功抑制了各个靶蛋白的表达，获得了稳定 沉默靶蛋白的血管瘤细胞。 抑制血管瘤生长、增殖及侵袭 westem 位点和ser 因沉默明显抑制肿瘤细胞生长、增殖及侵袭。靶向PDKl、RICTOR基因治