cd133阳性性肺癌细胞的分选、鉴定及差异基因的筛选.pdfVIP

CD133 阳性、CD133 阴性肺癌细胞的分选、鉴定及差异基因的筛选 CD133 阳性/阴性肺癌细胞的分选、鉴定及差 异基因的筛选 中文摘要 研究背景与目的 肿瘤耐药、转移和复发是恶性肿瘤临床治疗失败及患者死亡的主要原因，寻 找耐药和转移的相关基因是阐明肿瘤耐药和转移机制，解决肿瘤临床治疗的关 键。本研究拟利用肿瘤干细胞表面标记物——CD133 ，通过磁式分选的方法对肺 癌细胞株中的CD133阳性细胞及CD133阴性细胞进行分选，并对其生物学特性进 行鉴定。在此基础上，利用转移和耐药两种基因芯片对CD133 阳性/ 阴性细胞进 行对比检测，筛选转移、耐药的差异基因，旨在为肿瘤转移、耐药机制的研究提 供新线索，为肺癌的基因治疗提供新靶点。 方法 一、免疫组化方法检测81 例肺癌石蜡包埋组织及10 例正常肺组织中CD133 的表达，观察CD133 在组织中表达和分布情况；统计分析CD133 表达与肿瘤组 织学类型、肿瘤分级、临床分期的关系。免疫细胞化学方法检测 CD133 在人肺 腺癌细胞株A549 中的表达。 二、分别采用阳性分选柱（MS 柱）和阴性分选柱（LD 柱）通过磁式分选 的方法对人肺腺癌A549 细胞株中CD133 阳性细胞、CD133 阴性细胞进行分选， 并用免疫荧光染色法对分选细胞进行细胞纯度鉴定。 三、CD133 阳性细胞及CD133 阴性细胞分别在不含血清的DMEM-F12 培养 液（含EGF 、bFGF ）中进行体外培养，观察生长情况及“sphere ”形成情况。 四、平板克隆形成实验检测CD133 阳性细胞、CD133 阴性细胞及未分选细 胞克隆形成率，比较三者的增殖能力。 五、取形成“sphere ”的CD133 阳性细胞加入含10%胎牛血清的DMEM-F12 培基（不含 bFGF 、EGF ）进行体外诱导分化培养，观察诱导分化前后细胞的形 态差异；免疫细胞化学方法检测诱导分化前后细胞CD133、CK7 的表达情况。 六、采用SuperArray 第二代功能分类基因芯片对CD133 阳性细胞及CD133 阴性细胞分别进行肿瘤转移基因（84 个转移相关基因）、耐药基因（84 个耐药相 3 CD133 阳性、CD133 阴性肺癌细胞的分选、鉴定及差异基因的筛选 关基因）的对比检测，结合生物信息学技术分析两组之间的差异基因。 结果 一、肺癌组织中CD133 阳性肿瘤细胞呈分散或小灶状/巢状分布于癌巢边缘， 数量稀少。81 例肺癌标本CD133 表达阳性率为53.1% （43/81 ），CD133 表达与各 组织学类型的关系分析显示：鳞癌、腺癌及其他类型阳性率分别为48.3%（14/29）、 52.9% （18/34）和61.1% （11/18），CD133 的表达与组织学类型无关（P0.05 ）， 与肿瘤分级及临床分期无关（P0.05 ）。10 例正常肺组织中均未见CD133 阳性细 胞。 二、免疫细胞化学染色结果显示：人肺腺癌A549 细胞株中有CD133 阳性细 胞存在，数量稀少。 三、通过阳性分选柱（MS 柱）从人肺腺癌A549 细胞株中分选出的CD133 阳性细胞率约为0.2% 。 四、免疫荧光染色CD133 阳性细胞发红色荧光。经MS 柱分选的CD133 阳 性细胞中绝大部分细胞发红光荧光；经LD 柱分选的 CD133 阴性细胞中仅见少 量细胞发微弱的红色荧光，表明磁式分选所获得细胞纯度较高。 五、分选细胞培养可见，CD133 阴性细胞组培养24 小时见部分细胞呈贴壁 生长，CD133 阳性细胞组虽有细胞贴壁，但数量明显少于CD133 阴性细胞组。 两组贴壁生长的细胞培养 8 周全部死亡。CD133 阳性细胞组培养过程中大多数 细胞呈悬浮生长状态，持续可见少量细胞贴壁，于培养第 9 天出现“sphere” ； CD133 阴性细胞组悬浮细胞培养8 周未见“sphere”形成。 六、平