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CD36 对 LPS 诱导的自噬和炎症因子的影响及分子机制研究 中文摘要 中文摘要 目的：革兰阴性菌内毒素—脂多糖（Lipopolysaccharide ，LPS ）是其细胞壁结 构组分，当细菌死亡裂解时游离出来发挥毒性作用。CD36 作为一种模式识别受体 （pattern recognition receptor ，PRR ）可介导细胞识别LPS 等多种抗原，由于其特 殊的跨膜结构，还具有介导信号通路和调节细胞功能等作用；CD36 的泛素化能快 速调节其在细胞膜上的含量并影响其自身功能，因此藉用 CD36 泛素化位点的突变 可考察泛素化对其功能的影响。巨噬细胞（macrophage ）是机体重要的免疫细胞， 也是炎症反应的主要参与者。LPS 能有效地诱导巨噬细胞分泌 TNF-α和 IL-6 等炎 症因子，亦可诱导细胞自噬等反应参与抗感染免疫。CD36 作为一种重要的 PRR ， 在巨噬细胞中亦有丰富的表达，而对其在 LPS 诱导的巨噬细胞自噬和炎症因子分 泌中的影响及分子机制研究甚少；CD36 泛素化对其介导的信号通路和细胞功能有 何影响尚待研究。 野生型中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary cell，CHO ）无CD36 的天然 表达，同时该细胞还具有高扩增和表达特点，因此本课题第一部分以 LPS 与稳定 转染空质粒、野生型 cd36 基因和泛素化位点突变 cd36 基因的 CHO 细胞 （CHO/Vector、CHO/CD36 WT 和 CHO/CD36 K/A ）共作用,探讨CD36 及其泛素 化对 LPS 诱导的丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen activated protein kinase ，MAPK ） 信号通路和自噬的影响。第二部分首先利用 siRNA 和 ERK 抑制剂干预手段处理鼠 源巨噬细胞 RAW264.7 ，通过建立 LPS 与不同条件预处理的巨噬细胞 RAW264.7 共作用为细胞模型，研究巨噬细胞中 CD36 对 LPS 诱导的自噬和炎症因子分泌的 影响及分子机制，为阐明 CD36 对 LPS 诱导的自噬和炎症因子分泌的影响及分子 机制提供理论和实验依据。 方法： 一、CD36 及其泛素化对 MAPK 信号通路及自噬的影响 1. LPS 与 CHO 细胞共作用适宜浓度和时间的确定 本实验分别以 0、5、10、20 、50、100、200 、500、1000 ng/ml LPS 与 CHO/CD36 I 中文摘要 CD36 对 LPS 诱导的自噬和炎症因子的影响及分子机制研究 WT 细胞共作用相同时间后收集细胞；进而将 100 ng/ml LPS 与 CHO/CD36 WT 细 胞分别共作用 0、10、30、60、120、240 min 后收集细胞。采用蛋白质印迹技术（western blot ，WB ）检测上述所收集细胞中ERK 磷酸化水平，以确定 LPS 与 CHO 细胞共 作用适宜的浓度和时间。 2. CD36 及其泛素化对 MAPK 信号通路的影响 MAPK 信号通路参与细胞中多种生理病理过程并发挥着重要作用。在 MAPK 家族中细胞外调节蛋白激酶（Extracellular regulated protein kinase，ERK ）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK ）和p38 是研究最广泛和最重要的蛋 白激酶，其磷酸化水平高低决定了其活性程度。实验分别设置LPS 与 CHO/Vector、 CHO/CD36 WT 和 CHO/CD36 K/A 细胞共作用的组份及相应的未加 LPS 作用的阴 性对照组，共 6 组。根据上述实验确定的 LPS 工作条件，以 100 ng/ml LPS 作用细 胞 2 h 后，WB 检测 ERK 、JNK 和 p38 磷酸化水平，即 ERK 、JNK 和 p38 的活性。 3. CD36 及其泛素化对 LPS 诱导自噬的影响 蛋白激酶 C （protein kinases C ，PKC ）在自噬过