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中文 摘 要 GM-CSF签因cDNA克隆和序列分析 摘 要 目的:人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子(human granulocyte-macrophagecolonystimulatingfactor,huGM-CSF) 是人体内一种重要的细胞因子，主要由T细胞、B细胞、巨 噬细胞、肥大细胞、内皮细胞、成纤维细胞等产生，其中T 细胞、B细胞和巨噬细胞可在免疫应答或有丝分裂原刺激过 程中产生，内皮细胞、成纤维细胞可通过IL-1和T，NF的诱 导而产生。huGM-CSF基因位于染色体5g21-23，其cDNA 由432bp组成，编码由144氨基酸组成的糖蛋白。huGM-CSF 是一个多效的细胞因子:能在造血干细胞和祖细胞水平有效 刺激粒细胞和单核一巨噬细胞系增殖、分化和成熟;促进巨核 系细胞生长和血小板的生成;外源性huGM-CSF可刺激骨髓 内皮细胞增殖，以加强骨髓内皮细胞增殖对造血的调控作 用;huGM-CSF不仅可刺激未成熟前体细胞的增殖，还可提高 成熟血细胞的功能，延长其生存期;增强单核一巨噬细胞的吞 噬、细胞毒和杀伤肿瘤细胞的作用，促进细胞因子的表达、粘 附及氧化代谢;促进ADCC作用及Th,Tc,NK在肿瘤部位 浸润，从而杀伤肿瘤细胞:另外，buGM-CSF还作用于角质 细胞、成纤维细胞、粘膜细胞等。 huGM-CSF广泛的生物学作用，特别是对造血细胞的调 控，为其在临床上的应用提供了前提。人们经过长期的探索， 己成功研制出重组人粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子 (rhGM-CSF)，并于1993年获美国FAD批准用于临床。目 中文 摘 要 前，在国外，这种细胞因子已经应用于骨髓移植、再生障碍 性贫血、白血病治疗、肿瘤化疗引起的血细胞减少、抗感染、 疫苗佐剂诸多方面，并可望用于基因治疗，表现出广泛的发 展前景;在国内，这种细胞因子在临床上的应用也越来越多。 但是，由于GM-CSF有种属特异性，而目前应用的 GM-CSF产品多为原核表达产物，原核生物对于人属于不同 种属，其产物长期应用人体可导致DTH及抗体的产生。有 报道表明huGM-CSF基因还存在多态性，这种多态性是否影 响GM-CSF在不同种族的应用效果，目前还不清楚。应用 GM-CSF可产生很多不良反应，如感觉不是，发热，皮疹，肌 肉疼痛，骨疼，腹泻，注射局部红肿、硬结，偶见有低血压、 支气管痉挛、水肿及毛细血管渗漏等综合征。这些不良反应 的发生除了与剂量有关外，是否与huGM-CSF本身的基因有 关，目前也不清楚。 虽然基因治疗为临床疾病的治疗提供了新径，但基因治 疗对导入基因的要求更加严格。另外，临床研究显示， huGM-CSF与某些疾病有相关性，而且huGM-CSF有可能刺 激某些瘤细胞株的增殖。以上表明，目前应深入了解不同种 族huGM-CSF基因型，近早开发huGM-CSF真核表达产品， 加强对huGM-CSF特性的进一步研究。 目前，国内应用的huGM-CSF产品也多为原核表达产 物，而且多为进口制剂，他们应用于国人是否合理，至今尚 不清楚，国内huGM-CSF克隆和测序的报道也相对较少。所 以，目前有必要深入研究国人GM-CSF基因序列及GM-CSF 的特点。本研究目的就是在国内克隆GM-CSF基因。DNA并 进行测序，为进一步研究国人GM-CSF基因提供数据，并为 中文 摘 要 GM-CSF在我国临床上的合理应用提供一定的实验依据。 方法:取健康人新鲜肝素抗凝的外周静脉血，以等量 PBS稀释后，用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，收集单 个核细胞。将收集的单个核细胞，用含小牛血清、青霉素和 链霉素的DMEM重悬，取一滴重悬液涂片Giemsa-Wright 染色，高倍镜下观察单个核细胞。另取一滴重悬液，与台酚 兰染液混合，于血球计数板上计数。然后，用含小牛血清、 植物血凝素、佛波酷、青霉素和链霉素的DMEM培养液分 三组分别培养所收集的单个核细胞，培养时间依组为2小时、 4小时、6小时，然后收集各组培养细胞，并再次 Giemsa-Wright染色观察单个核细胞和台酚兰染液染色计数 单个核细胞。