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1 一个新精原干细胞系的建立、冻存、移植与后代产生 原喆，侯若愚，吴际* 上海交通大学生命科学技术学院，上海(200240) * E-mail：jiwu@ 摘 要： 精原干细胞具有自我更新和分化为成熟精子的能力。精原干细胞维持一定的数目 以及保持正常的增殖、分化功能是确保男性生育的关键。正是由于精原干细胞的这些重要性， 近年来越来越多的研究投入这个领域之中。在本研究中，我们第一次使用来源于成年 C57 + + 小鼠精原干细胞未经任何遗传修饰建立了一个新的细胞系。该细胞系表现为 Thy-1 , Oct4 , SSEA-1- - , C-kit 细胞亚群。经过长期维持培养和冻存、复苏，该细胞系在移植入经白消安处 理的受体小鼠后能够产生正常后代。 关键词：精原干细胞，细胞系，冷冻保存，干细胞移植，ISSR 指纹 1. 引 言 精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）通过自我更新和分化维持一定数量 [1]。精子发生的障碍可能源于 SSCs 的成熟精子，这一过程称为精子发生（spermatogenesis） 的异常或其微环境的异常，都会引起雄性的不育。SSC 的体外培养和移植是一条潜在的治疗 男性不育的途径，同时对于 SSCs 进行遗传修饰可治疗某些无法避免的遗传性疾病。因此研 究 SSCs 对于理解生殖系发育与雄性不育的机制都有着重大的意义。进一步的研究和临床应 用需要大量的 SSCs，但SSCs 的数量非常稀少，所以在获得供体细胞后，如何能够建立稳定 增殖的 SSC系便成为关键。由于原代 SSCs 在体外不易长期培养，因此，Brinster领导的研 究组将经分离纯化并短期培养的 SSCs 移植于小鼠或大鼠体内以研究其发育调控机理[2]。有 - 文献报道通过转染 SV40 large T 基因而建立了永生化的 SSC系，这一细胞系表型为 c-kit ， 在体内和体外都无法正常分化[3]。Feng 等人向 SSCs 转染包含 mTERT cDNA 的 pLXSN 病毒颗 粒，建立了小鼠 SSC 系，并诱导其分化为圆形精子细胞[4]。此后，一些研究小组运用了转 GFP 基因做标记的手段得到后代小鼠[5][6]。但这些研究中所用的细胞供体均为幼龄小鼠，现实情 况中，人类的睾丸捐赠者多位成年男性[7]。并且出于安全性和伦理方面的考虑，人类 SSC 建 系不能使用包含遗传修饰的方法。因此，利用成年个体的睾丸分离 SSCs 并建立细胞系成为 了亟待解决的问题。至今尚未见成体 SSC 成功建系并移植产生后代的报道。研究表明，支持 细胞分泌的一种神经胶质源的神经营养因子（GDNF）在 SSCs 的增殖和自我更新的过程中起 [8] [9] 重要作用 。但有研究显示 GDNF 对 C57 小鼠SSCs增殖未见显著影响 。研究表明 LIF对 KM 小鼠 SSCs 增殖无显著影响[10]，在本研究中，我们首次使用成年雄性 C57 小鼠SSCs，不经过 遗传修饰，建立并长期维持了一个“自然”的SSC 细胞系[11]，通过移植成功获得了正常的后 代。从供体细胞的获得，稳定细胞系的建立，冷冻保藏，复苏培养，细胞移植，到亲缘关系 鉴定的全部过程为未来的临床转化提供了潜在的模型。 1本课题得到教育部高等学校博士学科点专项科研基金（项目编号：20050248010 ）;