- 1、本文档共94页,可阅读全部内容。
- 2、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
- 3、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载。
- 4、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
查看更多
植物病原细菌学实验 二、实验内容和操作方法 实验二 植物病原细菌的分离 和致病性测定 二、实验内容和操作方法 实验三 植物病原细菌的形态观察? 二、实验内容和操作方法 实验五 植物病原细菌的PCR分子鉴定 ? 1、PCR反应: A. 取0.5ml 的eppendorf 管中依次加入效率试剂(共50?l): 35?l H20 5?l 10X PCR反应缓冲液 4?l 25 mmol/L MgCl2 4?l 4种 dNTP 0.5?l 上游引物(引物1) 0.5?l 下游引物(引物2) 0.5?l 模板DNA(约1ng) 0.5ul Taq DNA聚合酶(约2.5单位) 混匀后离心5秒钟 B.混合物在94℃下加热5min 。 C.94 ℃变性30秒种,62℃退火1分钟,72℃延伸2分 钟,循环30轮,进行PCR。最后一轮循环结束后,于 72℃下保温10分钟,使反应产物扩增充分。 2、电泳:取10 ul扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。 1 了解PCR反应的原理; 掌握PCR反应的操作方法。 一、实验目的 二、PCR扩增 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR) 1、PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与目标序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR由变性--退火--延伸三个反应步骤构成: ①模板DNA的变性:模板DNA经加热至94℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链(以便它与引物结合,为下轮反应作准备); ②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合; ③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链,重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 2 The procedure of PCR 5’ 5’ 3’ 3’ d.NTPs Taq Primers 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ component denaturation 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ (94℃) extension 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Taq Taq 5’ 5’ repeated anneal (72℃) (50℃) 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 2 cycles 4 copies 3 cycles 8 copies 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 10×反应缓冲液(含Mg2+) 5.0 ?l dNTP混合物,10 mmol/L 1.0 ?l 上游引物,20 ?mol/L 1.0 ?l 下游引物,20 ?mol/L 1.0 ?l 模板DNA 1.0 ?l Taq plus DNA聚合酶,5 U/?l 0.5 ?l 加双蒸水至终体积为50 ?l ? 3 反应体系 取一0.5 ml PCR薄壁管,依次加入以下试剂: M 1 2 3 4 ? 3kb 2kb 0.8% agrose gel electrophoresis of full length PCR product from Y160 M: DNA marker; 1: Y160; 2:positive control; 3 4: CK- 2.7kb 引物量: 每条引物的浓度0.1~1umol或
您可能关注的文档
- 支气管哮喘病人的护理解读.ppt
- 运筹学课件-解读.ppt
- 支气管哮喘病人护理解读.ppt
- 运筹学课件排队论解读.ppt
- 支气管哮喘的护理(带案例)解读.ppt
- 运筹学课件网络计划技术解读.ppt
- 支气管哮喘的诊断和鉴别诊断ywz解读.ppt
- 运筹学课件--绪论解读.ppt
- 运筹学课件--整数规划解读.ppt
- 运筹学期末考试复习解读.ppt
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit13【速记清单】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit9【速记清单】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit11【速记清单】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit14【单元测试·提升卷】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit8【速记清单】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit4【单元测试·提升卷】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit13【单元测试·基础卷】(原卷版+解析).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit7【速记清单】(原卷版+解析).docx
- 苏教版五年级上册数学分层作业设计 2.2 三角形的面积(附答案).docx
- 人教版九年级英语全一册单元速记•巧练Unit12【单元测试·基础卷】(原卷版+解析).docx
文档评论(0)