植物分子生态学解读.ppt

第二章　植物分子生态学研究方法 第一节　分子标记及其发展概况 植物分子生态学的一个重要特征就是应用分子生物学的研究手段来解决植物生态学领域的问题。 广义的分子标记是指：蛋白质标记和DNA标记。 狭义的分子标记，即DNA标记。 第二章　植物分子生态学研究方法 第二节　分子生态学研究中的常用工具 * * 广义的分子标记: 在分子生物学形成与发展过程中，标记手段在植物生态学研究中的应用蛋白质研究及标记早于DNA的研究及标记。 20世纪60年代出现的等位酶标记就是一种典型的蛋白质分子标记，该手段曾被广泛应用于种群生态学中种群内与种群间等位基因频率的确定、种群适合度以及种群间趋异程度的研究，并取得了巨大成就。但由于等位酶缺乏足够的变异，在研究种群内个体间的遗传关系时则显得信息量相当有限。 狭义的分子标记，即DNA标记。 限制性片段长度多态性标记--RFLP （1970以后）,其机理是：通过特定限制性内切酶切割产物的差异来显示样本间DNA的差异。 此后，以DNA聚合酶链式反应技术的产生而产生的。体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法（1983，Mullis，美国），不仅是分子生物学领域的一次革命，还直接推动了生态学、考古学等领域研究手段的革新。以此方法为基础，先后又出现了随机扩增多态性DNA 标记（RAPD）、扩增片段长度多态性标记（AFLP）以及简单序列重复标记（SSR）等。 DNA分子标记手段的兴起，在很大程度上克服了蛋白质标记信息量有限的问题。运用合适的手段甚至可以检测到种内个体间单个核苷酸碱基的差异。 DNA标记所代表的遗传特征在同一生物体的各个生长发育时期和不同器官中都是稳定的，从而避免了蛋白质分析中个体本身表达差异的影响。 利用DNA分子标记有如下优点： ①不受环境因素影响； ②不受植物生长发育时期的影响； ③不受基因表达与否的限制； ④取样不受组织器官的限制； ⑤DNA分子标记的数量几乎是无限的； ⑥许多DNA分子标记是共显性标记，对隐性经济性状选择十分方便。 同时用于DNA标记分析的实验材料易于获 得，从化石到活体材料都可以，所需材料 量很少，配合PCR扩增时，仅需ng级水平 DNA。 一、蛋白质标记 蛋白质标记是在蛋白质多态性基础上发展起来的分子标记形式。 一般蛋白质分析程序都包含三大步骤: 蛋白质的提取; 蛋白质分离纯化; 蛋白质分析。 蛋白质的提取是通过机械或化学手段使细胞破碎后，使蛋白质溶解在提取介质中。 蛋白质提取、分离纯化和分析最常用方法是蛋白质电泳。 蛋白质分离纯化后，主要通过两种途径分析: (1)将目标分子回收浓缩后，进行氨基酸序列分析； (2)电泳后直接在载体上进行特异性显色分析。 二、Southern杂交 Southern杂交（Southern blot）也称Southern印迹，是Southern于1975年首创的一种DNA检测方法。 原理: 两条单链DNA（或一条DNA与一条RNA）中互补碱基的专一性配对。 Southern杂交操作过程: ①是基因组DNA的酶切与电泳分离； ②DNA片段的转移。转移方法： A、向上毛细管转移法； B、向下毛细管转移法； C、同时向两张膜转移的方法； D、电转移； E、真空转移法。 Southern杂交的最后步骤----对固相支持物上DNA片段的标记与解读。即用已知并标记的DNA、RNA或寡核苷酸片段与固相支持物上的DNA片段杂交，最后通过特定的检测手段如放射自显影等确定与探针互补的DNA位置所在。 Southern杂交技术的改进----使用尼龙膜代替硝酸纤维素膜作为固相支持物，前者比后者更耐用、结合力更强，正是该尼龙膜的出现，使电转移法转移DNA得以成功。 在分子生态学研究过程中，Southern杂交手段经常与其他手段结合使用，如RFLP等，具体的操作流程和应用实例也已经有大量的文献和实验指导书可供参考，这里不再详述。 三、DNA分子标记 DNA分子标记即基于DNA分子多态性而建立起来的标记形式。 DNA标记所代表的遗传特征在同一生物体的各个生长发育时期和不同器官中都是稳定的，从而避免了蛋白质分析中个体本身表达差异的影响。 （一）RFLP 限制性片段长度多态性标记----RFLP标记（Bostein,1980）是一种分子遗传标记。 原理:利用限制性内切酶位点专一性的特点，将DNA酶切消化后产生许多长短不一的片段，这些片段的数目与长度反映了DNA上限制性位点的分布，对某一特定DNA序列／限制性内切酶组合，所产生的片段也是特定的，它能作为该DNA或含有该DN