中期因子诱导肝细胞抗失巢凋亡的作用及其分子机制的研究.pdfVIP

中期因子诱导肝癌细胞抗失巢凋亡的作用及其分子机制的研究 中文摘要 中期因子诱导肝癌细胞抗失巢凋亡的作用 及其分子机制的研究 中文摘要 研究背景和目的 肿瘤转移是一个多因素参与、多阶段发展的极其复杂的动态过程。肿瘤细胞脱离 原发灶，侵入血管或淋巴管中，形成循环肿瘤细胞 （circulating tumor cells ，CTCs ）。 然后CTCs 通过血液循环系统在远隔器官中溢出、增殖，最后形成转移灶。失巢凋亡 是细胞与细胞外基质或邻近细胞失去接触而导致的一种特殊的细胞死亡方式，在组织 发育和机体平衡中起着重要作用，也是肿瘤细胞转移的一道屏障。然而，部分CTCs 形成某种机制逃逸失巢凋亡，得以存活下来并播散到全身。中期因子（midkine ，MK ） 是糖胺聚糖或肝素结合生长因子家族的成员之一，在许多恶性肿瘤中高表达，并参与 肿瘤发生、转移过程。以前我们的研究表明，MK 在肝癌组织和血清中表达增高，并 且与肝癌肝内转移和CTCs 形成有关。我们推测MK 可能参与失巢凋亡抵抗机制，介 导肝癌CTCs 在血液循环中存活的调节。本课题通过悬浮培养肝癌细胞，建立失巢凋 亡模型，并验证该模型的可行性，为后续MK 诱导的抗失巢凋亡实验奠定基础。然后 通过体外细胞实验研究MK 诱导肝癌细胞抵抗失巢凋亡的特性，初步探讨可能涉及的 分子机制。 研究方法 1. 悬浮培养肝癌细胞，建立失巢凋亡模型。 将肝癌细胞接种于铺有Poly-HEMA 胶的6 孔板中进行悬浮培养，并与贴壁培养 进行比较研究。 （1）光镜下观察在不同培养条件下肝癌细胞的生长状态和形态学变化。 （2 ）TUNEL 法检测细胞凋亡。 （3 ）流式细胞术（Annexin V-FITC/PI 双染法）检测细胞凋亡和细胞周期的变化。 I 中文摘要 中期因子诱导肝癌细胞抗失巢凋亡的作用及其分子机制的研究 2. 研究MK 促进悬浮培养的肝癌细胞凋亡抵抗、增殖和侵袭的作用。 （1）流式细胞术 （Annexin V-FITC/PI 双染法）检测细胞凋亡。 （2 ）MTS 法检测细胞增殖。 （3 ）Transwell 法检测细胞侵袭。 3 ．研究MK 诱导肝癌细胞抵抗失巢凋亡的分子机制。 （1）免疫荧光染色法检测悬浮培养的肝癌细胞经MK 处理后NF-κB 表达的变化。 （2 ）流式细胞术检测悬浮培养的肝癌细胞经MK、AKT 抑制剂和NF-κB 通路抑 制剂单独或联合处理后细胞凋亡率的变化。 （3 ）Western Blot 分析悬浮培养的肝癌细胞经MK 处理后NF-κB 、AKT 信号通 路关键分子及相关凋亡蛋白Bcl-2 和caspase-3 的表达变化。 实验结果 1. 建立了肝癌细胞失巢凋亡模型。 （1）悬浮培养的肝癌细胞体积缩小，形态变圆，并聚集成团生长。 （2 ）TUNEL 染色结果显示，悬浮培养的肝癌细胞晚期失巢凋亡明显高于贴壁培 养的相同肝癌细胞，晚期失巢凋亡率分别为 （28.76 ±3.49）% vs. （5.42 ±0.79 ）% 。 差异具有统计学意义（P0.05 ）。 （3 ）流式细胞术检测结果显示，在悬浮培养和贴壁培养条件下，Hep3B 肝癌细 胞总凋亡率均随着时间延长（72 h 内）而增高，呈时间依赖性；在不同时间点（24 h、 48 h 和72 h ），悬浮培养的肝癌细胞失巢凋亡均明显高于贴壁培养的相同肝癌细胞， 总凋亡率之间均有统计学意义（P0.05 ）；PI 染色结果表明，随着培养时间延长（24 h、 48 h 和72 h ），G1 期细胞比率逐渐增加，分别为44.17% 、57.99%和66.99% 。细胞静 止在G1/S 期。 2 ．MK 能够增强悬浮培养的Hep3B 肝癌细胞失巢凋亡抵抗、增殖和侵袭能力。 （1）MK 能够诱导悬浮培养的Hep3B 肝癌细胞抵抗失巢凋亡。用不同浓度MK （10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL 和200 ng/mL ）处理悬浮培养的肝癌细胞24 h 后，